Mus81基因沉默对MCF-7人乳腺癌细胞系增殖凋亡及化疗敏感性的影响

常颖智 赵俐 张年伟 熊白玉 吴帆

1广州市第一人民医院，华南理工大学附属第二医院乳腺外科（广州 510180）；2广州市红十字会医院普通外科（广州 510220）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，现随着一系列靶向药物的面世，乳腺癌患者的预后得到了明显提升［1-2］。但由于部分乳腺癌对传统内分泌及靶向治疗均不敏感，因而寻找新的有效的治疗靶点对改善乳腺癌预后至关重要［3］。甲磺酸盐及紫外线敏感性81 号基因（methyl methanesulfonate and UV sensitive gene clone 81，Mus81）是定位于人11 号染色体长臂的DNA 修复基因，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关［4-5］。已有研究［6-7］提示Mus81 是一个潜在的肿瘤治疗靶点，沉默Mus81 基因的表达可抑制人结肠癌、肝癌细胞系的增殖并促进凋亡，还可提高结肠癌及肝癌细胞系对化疗药物的敏感性。但关于Mus81 基因在乳腺癌中的作用及调控机制的研究目前还很少，尚有待进一步研究阐明［8-9］。为此，本研究沉默MCF-7 细胞系中Mus81 基因的表达，以观察其对MCF-7 细胞增殖、凋亡、细胞周期及化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料人乳腺癌MCF-7 细胞系购自上海吉凯基因化学技术有限公司。M-MLV 试剂盒购自Promega 公司；MTT 试剂购自上海鼎国生物技术有限公司；凋亡试剂盒购自美国Ebioscience 公司；PI 染色试剂盒购自德国Sigma 公司。

1.2 慢病毒介导的siRNA针对Mus81 目的基因序列，设计如下RNA 干扰靶点序列：正义链：5′-CCGGGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAAT -GTGATCCAGTACCAACTCTTTTTG-3′；反义链：5′-AATTCAAAAAGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTC-3′；阴性对照序列为：正义链：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′；反义链：5′-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTTCTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。引物退火制备上述目的基因片段后与线性化载体连接并转化，筛选、抽提获取高纯度质粒。将上述质粒转染至293T 细胞，收集Mus81 沉默及阴性对照慢病毒感染MCF-7 细胞，分别命名为Mus81沉默组（Mus81-siRNA）及阴性对照组（NC-siRNA）MCF-7 细胞。感染3 d 后观察慢病毒感染效率并采用RT-qPCR 检测分析Mus81 基因的干扰效率。

1.3 RT-qPCR 检测Trizol 试 剂提 取MCF-7 细 胞总RNA，反转录获得cDNA，行PCR 检测，反应条件为：95 ℃预变性15 s，然后95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共进行45 个循环。采用2-ΔΔCT法分析基因表达水平。

1.4 MTT检测每组设3个复孔，将MCF-7细胞接种于96孔板，第2 天加入10 μL 的MTT（5 mg/mL），4 h 后吸去培养液，加入100 μL 二甲基亚砜。酶标仪检测490 nm 吸光度（OD）值，绘制细胞生长曲线。

1.5 细胞克隆形成实验将MCF-7 细胞以800 个细胞/孔接种于6 孔板，每组设3 个复孔，培养至14 d，中途每隔3 d进行换液。磷酸盐缓冲液洗涤后加入1 mL 4%多聚甲醛固定30～60 min。加入结晶紫染液1 mL染细胞15 min，ddH2O洗涤后克隆计数。

1.6 细胞凋亡检测每个实验组设3个复孔，MCF-7细胞以1 300 rmp 离心5 min，PBS 洗涤细胞。1×binding buffer 洗涤细胞沉淀1 次，1 300 rmp 离心3 min。200 μL 1×binding buffer 重悬细胞沉淀，加入10 μL Annexin V-APC 染色，上机检测。

1.7 细胞周期检测每个实验组设3 个复孔，以1 300 rmp 离心5 min，PBS 洗涤细胞沉淀。再次以1 300 rmp 离心5 min 后加入配制好的PI 染色液重悬，上机检测。

1.8 MTT 法测定化疗药物敏感性以顺铂、阿霉素、表阿霉素及5-氟尿嘧啶等4 种化疗药物按5 个浓度梯度（表1），分别处理Mus81 沉默组MCF-7 细胞和阴性对照组细胞，以未经化疗药物处理的阴性对照组MCF-7 细胞作为空白组，MTT 检测步骤同1.4，重复实验3 次。绘制浓度-抑制率曲线并计算各化疗药物对两组细胞的50%抑制浓度（IC50值），并计算Mus81 沉默对各化疗药物的逆转指数（reverse index，RI）。

表1 各化疗药物的处理浓度Tab.1 The treatment concentrations of every chemotherapy drug

1.9 Western blot 检测提取细胞总蛋白，以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转至PVDF 膜。依次加入兔抗人STC2、APAF1、APC、PTEN、MAPK3或MAPK1 抗体及相应二抗中孵育，经显影曝光摄片。以小鼠抗人β-actin抗体检测相同样本作为内参照。

1.10 统计学方法应用SPSS 13.0 软件进行统计分析，计量资料比较采用Student′st检验，生长曲线采用重复测量资料的方差分析。所有分析均为双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Mus81 的干扰效率荧光显微镜观察显示两组细胞感染效率均高于80%（图1A）。RT-qPCR 结果显示Mus81 沉默组的Mus81 表达水平明显低于阴性对照组［（0.272 ± 0.065）vs.（1.004 ± 0.116），P＜0.001，图1B］，Mus81基因的沉默效率达72.8%。

2.2 MTT 生长曲线检测Mus81 沉默组的MCF-7细胞吸光度值自第2天开始明显低于阴性对照组，两组生长曲线之间差异有统计学意义（P＜0.01，图1C），提示Mus81沉默后MCF-7细胞的生长速度明显减缓。

2.3 平板克隆形成实验Mus81 沉默组的细胞克隆数为（55 ± 5），明显低于阴性对照组（273 ± 4），两组差异有统计学意义（P＜0.001，图1D），提示Mus81 沉默明显抑制了MCF-7 细胞的增殖。

2.4 细胞凋亡检测Mus81 沉默组的细胞凋亡率为（10.10±0.30）%，明显高于阴性对照组的凋亡率（3.87±0.06）%（P＜0.001，图1E），提示Mus81 沉默显著促进了MCF-7 细胞的凋亡。

2.5 细胞周期检测Mus81 沉默组MCF-7 乳腺癌细胞中处于G1期的比例低于对照组［（32.00±1.87）vs.（47.76 ± 0.92），P＜0.001］，而处于G2/M 期的比例高于对照组［（21.75 ± 0.29）vs.（11.10 ± 0.36），P＜0.001］，两组细胞中处于S期的比例差异无统计学意义［（41.85±1.29）vs.（40.70±0.70），P＞0.05，图1F］，提示Mus81 沉默组MCF-7 细胞出现了明显的G2/M期阻滞。

图1 沉默Mus81 基因对乳腺癌MCF-7 细胞生长、增殖、凋亡和细胞周期的影响Fig.1 Effects of Mus81 gene silencing on the growth，proliferation，apoptosis and cell cycle of breast cancer MCF-7 cells

2.6 Mus81 沉默对化疗敏感性影响顺铂、阿霉素、表阿霉素和5-氟尿嘧啶对Mus81 沉默组的IC50均明显低于阴性对照组（图2），Mus81 基因沉默对各化疗药物的RI 见表2，提示Mus81 沉默可明显提高MCF-7 细胞对顺铂、阿霉素、表阿霉素和5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。

图2 顺铂、阿霉素、表阿霉素和5-氟尿嘧啶对两组MCF-7 细胞的剂量-抑制率曲线Fig.2 Dose-inhibition rate curve of cisplatin，adriamycin，epirubicin and 5-fluorouracil on two groups of MCF-7 cells

表2 各化疗药物对两组MCF-7 细胞的IC50及RI 值Tab.2 The values of IC50 and RI for the chemotherapy drugs on two groups of MCF-7 cells

2.7 Mus81 下游蛋白及基因表达水平Mus81 沉默组MCF-7 细胞中APAF1、APC 及PTEN 蛋白的表达水平明显升高，MAPK3 和MAPK1 蛋白的表达水平明显下降，STC2 蛋白的表达水平则无显著变化。qRT-PCR 检测显示APAF1、APC 和PTEN 在Mus81 沉默组中的表达较对照组升高，特别是APAF1 基因表达升高超过2.0 倍，APC 基因表达升高超过1.5 倍，而MAPK3 和MAPK1 的表达则明显降低（图3）。

图3 Mus81 下游蛋白及基因表达水平结果Fig.3 The results of protein and gene expression levels downstream of Mus81

3 讨论

既往研究显示，Mus81 在乳腺癌组织中表达下调，并且其表达水平与乳腺癌TNM 分期相关［9］。本研究的细胞学实验显示Mus81 基因沉默后可抑制人乳腺癌细胞系的生长及克隆。这些结果与笔者前期在结肠癌细胞系及肝癌细胞系中获得的结果相一致，进一步提示Mus81 可促进肿瘤细胞的生长增殖［10］。但是，吴云路［8］等的结果显示，过表达Mus81 可抑制人乳腺癌SKBR3 细胞系的增殖能力；YIN 等［11］在胃癌中的研究则显示Mus81 沉默对胃癌细胞系的增殖无明显的影响，提示Mus81 可能对不同的恶性肿瘤细胞的增殖具有不同的影响。进一步研究发现Mus81 沉默明显促进了MCF-7 细胞的凋亡。这与Mus81沉默促进人结肠癌细胞和肝癌细胞的凋亡结果相一致，提示Mus81 沉默引起的细胞凋亡可能是导致MCF-7 细胞增殖抑制的原因之一。考虑到细胞周期阻滞是诱发细胞凋亡的常见原因，本研究也发现Mus81沉默可诱导MCF-7细胞出现G2/M 期阻滞，这与HIYAMA 等［12］在HCT116人结肠癌细胞系中观察到的结果一致，提示Mus81沉默诱导的G2/M 期阻滞可能是导致MCF-7细胞生长增殖减缓并促进凋亡的原因之一。

QIAN 等［13］研究Mus81 对化疗药物敏感性的影响发现，沉默Mus81可增强MCF-7和T47D乳腺癌细胞对5-FU 药物的敏感性。本研究不仅进一步验证了Mus81 沉默可显著提高MCF-7 细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性，还发现Mus81 沉默可明显提高MCF-7 细胞对顺铂、阿霉素、表阿霉素等其他常用化疗药物的敏感性，提示Mus81 沉默可与上述化疗药物联用以提高总体敏感性或减少化疗药物的用量以降低化疗药物的毒副作用。综合以上研究提示，Mus81 基因在调控乳腺癌细胞增殖凋亡及化疗药物敏感性上发挥了重要的作用，有望成为一个潜在的乳腺癌治疗靶点。

为了初步探究Mus81 沉默抑制MCF-7 细胞增殖凋亡并调控化疗敏感性的机制，本研究对前期研究中发现的6 个Mus81 下游基因表达水平进行检测，结果显示APAF1、APC 和PTEN 在Mus81 沉默组MCF-7 细胞中的表达升高，而MAPK3 和MAPK1表达降低，其中又以APAF1 和APC 表达水平的变化幅度最大，这与本研究团队前期在肝癌中获得的结果基本一致［10］。已有的研究发现APAF1对细胞凋亡起促进作用，APAF1 的过表达可抑制MCF-7细胞的增殖并促进细胞凋亡，还可将MCF-7 细胞阻滞在G1/S 期［14-15］。APC 则是一种多功能抑癌基因，LV 等［16］研究发现miR-135b 可通过下调APC 表达进而促进三阴性乳腺癌的增殖和侵袭。综合文献报道及本研究结果，推测Mus81 沉默可能通过影响APAF1、APC 等基因的表达调控MCF-7 细胞的增殖凋亡及化疗敏感性，但Mus81 调控下游基因的具体机制仍有待研究。

综上所述，本研究发现Mus81 基因沉默可明显抑制MCF-7 细胞系的生长增殖并诱导G2/M 期阻滞及细胞凋亡，还可提高MCF-7 细胞对顺铂、阿霉素、表阿霉素和5-氟尿嘧啶等化疗药物的敏感性，其机制可能与调控APAF1、APC 等下游基因的表达水平有关，提示Mus81 可能是一个潜在的乳腺癌治疗靶点。