不同细胞工厂制备F 基因型腮腺炎减毒活疫苗（人二倍体细胞）的比较

杨振清，刘喜苹，文韬，李涛，艾晗，段黎恒，张玉平，王文慧，王晶晶

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118

KMB17 细胞是由中国医学科学院医学生物学研究所于1973年研制的人二倍体细胞株，1974年经我国卫生部批准，可用于人用疫苗生产［1］。目前，该细胞株已用于多种病毒疫苗的生产，并证明具有较好的安全性［2］。由中国医学科学院医学生物学研究所自行研制的F 基因型腮腺炎减毒活疫苗就是以该细胞为培养基质，目前已完成Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，显示出较好的免疫原性［3］。为了进一步提高产能，在即将开展的Ⅲ期临床试验样品制备中，采用了聚苯乙烯细胞工厂作为细胞培养容器，因此，首先要确定KMB17 细胞在聚苯乙烯细胞工厂的增殖情况，才能为后续疫苗的工艺研究提供依据［4-5］。

细胞工厂培养技术近10年来才在我国开始普及应用，其特点在于可在有限的空间内将培养面积最大化，单层培养面积为632 cm2，国外的细胞工厂厂家可提供1、10、40 层的选择，使得疫苗的规模化放大生产更具有可操作性。为了保证疫苗质量的安全性，细胞工厂多为一次性使用，增加了生产成本，目前国内已有厂家获准其生产的聚苯乙烯细胞工厂用于疫苗生产［6-10］。

本实验应用不同厂牌细胞工厂，在细胞培养液中加入不同浓度的血清，对人二倍体细胞进行连续传代培养，观察其生长情况和细胞得率，判断不同细胞工厂在不同血清条件下对细胞生长的影响，并在不同细胞工厂中制备病毒收获液和疫苗原液，比较病毒滴度和热稳定性，同时按照《中国药典》三部（2020 版）要求进行相关检测，以期为后续F 基因型腮腺炎减毒活疫苗产业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞及毒种 人胚肺二倍体细胞KMB17 由本所保存；腮腺炎病毒SP-A 株为中国医学科学院医学生物学研究所于2005年分离，经全基因测序为F 基因型（GenBank 登录号：DQ 649478），本研究使用的毒株为24 代，复苏时细胞代次为16 代。

1.2 主要试剂及仪器 新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司（批号：20180724），经本所QC 检定符合内控要求；MEM 培养购自美国Gibco 公司；硫酸卡那霉素购自遂成药业股份有限公司；胰蛋白酶、EDTA、氢氧化钠和谷氨酰胺购自美国Sigma 公司；鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司；0.01 mol ／ L PBS 由本所配制；96 孔细胞培养板购自美国Thermo公司；无菌检查用培养基购自北京三药科技开发公司；集菌仪购自默克密理博公司；无菌隔离器购自上海东富龙爱瑞思科技有限公司；细胞工厂分别购自无锡耐思生物科技有限公司（医疗器械生产许可证号：苏食药监械生产许20190045 号）和美国康宁公司（符合医用包装材料EN ISO13485 检测标准）；显微镜购自德国Leica 公司；无菌检查用培养箱购自重庆雅马拓科技有限公司。

1.3 细胞复苏及传代 将细胞从液氮罐取出，置于37 ～40 ℃注射用水中，至细胞种子融化，置入T225培养瓶中，加入150 mL 含10%新生牛血清、100 UI／mL硫酸卡那霉素、3%谷氨酰胺、6.6%碳酸氢钠的MEM 培养基，于37 ℃放置24 h 后，再次加入新配制的MEM 培养基，待细胞长成致密单层后进行传代：用PBS 清洗1 次，加入0.25%胰蛋白酶消化液，其中1 L 细胞消化液中含83 mL PBS 使用液，12 mL 1%胰蛋白酶，3 mL 1 mol／L NaOH，3 mL 4%EDTA·2Na，至细胞均匀分散后继续传代。

1.4 10 层细胞工厂培养 将传代后的KMB17 细胞分为细胞工厂A 组（无锡耐思生物科技有限公司）和细胞工厂B 组（美国康宁公司），培养基血清浓度分为10%、8%和5%，每个血清浓度8个细胞工厂，将细胞按照2 × 105个 ／ mL 的终浓度接种于细胞工厂中，共传代 3 次，其余成分为 100 UI ／ mL 硫酸卡那霉素、3%谷氨酰胺、6.6%碳酸氢钠，于37 ℃培养4 d，显微镜下观察细胞生长情况。

1.5 细胞计数 将生长为致密单层的KMB17 细胞用0.25%胰蛋白酶消化3 ～5 min，分散均匀后，按照一定稀释倍数加入计数室（4个大方格），每个计数室数左上、右上、左下、右下大方格中的细胞，压线细胞按数上不数下，数左不数右的原则进行计数，按下式计算每毫升溶液中所含细胞数。

每毫升溶液中所含细胞数=8个大方格中的细胞数／8×稀释倍数× 104

1.6 病毒接种 待KMB17 细胞长成单层后计数，按照0.020 MOI 接种腮腺炎病毒，加入无血清病毒维持液，于37 ℃培养7 ～9 d，收集病毒收获液，经50 μm + 10 μm 两级澄清过滤后，即为疫苗原液。

1.7 病毒滴度检测 病毒滴定采用微量细胞病变法。将毒种10 倍系列稀释，取至少3个稀释度病毒液接种KMB17 细胞，每个稀释度接种8 孔，0.10 mL／孔，置（37 ± 0.5）℃培养10 d，判定结果。同时将病毒收获液和疫苗原液样品于4 ℃条件下放置14 d、37 ℃条件下放置7 d，再检测病毒滴度。

1.8 安全性指标检查 对A 组和B 组细胞工厂制备的3 批病毒收获液和疫苗原液，按照《中国药典》三部（2020 版）方法进行全面安全性指标检查，包括无菌检查、分枝杆菌、支原体和细菌内毒素检查。

1.9 统计学分析 应用SPSS 12.0 软件进行统计学分析，细胞收获量的比较采用配对t 检验，病毒滴度的比较采用方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞生长状态 A 组和B 组细胞工厂培养KMB17细胞至24 h，细胞已成片生长；至第48 h 时，细胞汇合度达70%；至第72 h 时，达100%，并可见细胞形态呈梭状特征，界限清晰，排列整齐，细胞立体感和折光性均较好。见图1。

图1 不同细胞工厂培养KMB17 细胞不同时间的显微镜观察（× 100）Fig.1 Microscopy of KMB17 cells in different cell factories for various hours（× 100）

2.2 细胞收获量的比较 使用A 组和B 组细胞工厂培养KMB17 细胞，在培养基血清浓度分别为10%、8%和5%的条件下，细胞连续传代3 次的收获量均值均大于4.00 × 108个 ／ 细胞工厂，在相同血清浓度下，A 组与B 组细胞工厂获得的细胞数均值差异无统计学意义（t 分别为 0.14、0.88 和 0.47，P 均 ＞0.05），能满足后续生产要求所需细胞量，见图2。

图2 不同血清培养条件下KMB17 细胞在不同细胞工厂中收获量的比较Fig.2 Comparison of cell harvests of KMB17 cells in different cell factories under different serum culture conditions

2.3 病毒滴度的变化 使用5%血清浓度的培养基培养KMB17 细胞，两组细胞工厂培养的病毒收获液和疫苗原液感染性滴度均高于10%和8%血清浓度，感染性滴度均值为 6.50 LgCCID50／ mL。4 ℃放置14 d 后，A 组细胞工厂病毒收获液滴度下降0.46 LgCCID50／mL，疫苗原液下降 0.41 LgCCID50／mL；B 组细胞工厂病毒收获液滴度下降0.41 LgCCID50／mL，疫苗原液下降0.37 LgCCID50／mL。37 ℃放置7 d 后，A 组细胞工厂病毒收获液滴度下降1.50 LgCCID50／mL，疫苗原液下降 1.38 LgCCID50／ mL；B 组细胞工厂病毒收获液滴度下降1.63 LgCCID50／ mL，疫苗原液下降1.38 LgCCID50／ mL。不同细胞工厂在10%、8%和5%血清浓度下制备的病毒收获液和疫苗原液病毒滴度差异均无统计学意义（t 分别为0.02、0.92 和0.85，P 均 ＞0.05），表明两组细胞工厂均可用于制备SP-A 株F 基因型腮腺炎减毒活疫苗。见表1。

表1 不同血清条件下不同细胞工厂制备的病毒收获液和疫苗原液病毒滴度变化（LgCCID50／ mL）Tab.1 Changes of virus titers in virus harvests and bulk prepared in different cell factories under different serum culture conditions（LgCCID50 ／ mL）

2.4 安全性指标 两组细胞工厂制备的3 批病毒收获液和疫苗原液的无菌、分枝杆菌和支原体检查结果均为阴性，细菌内毒素均不超过50 EU ／ 剂，检测结果均符合《中国药典》三部（2020 版）标准。

3 讨 论

目前，国际公认人二倍体细胞为人用疫苗生产最安全的细胞基质，是传统工艺疫苗开发的首选。但人二倍体细胞培养条件和技术要求较高，目前尚未攻克应用生物反应器进行大规模工业化培养的技术难题，制约了以人二倍体细胞为基质的疫苗产量及其在疫苗开发方面的应用［11-12］。细胞工厂是贴附型细胞培养系统，在国外已应用30 多年，近10年在我国逐步开始应用，可用于多种贴附型细胞的培养。国内已有多个疫苗生产企业获准利用细胞工厂制备人用疫苗，细胞工厂可高效利用有限的恒温培养空间提供最大限度的细胞培养表面，在无需改造现有生产设施和新建生产车间的情况下，短期内即能实现产能提升［6-10］。进口细胞工厂的一次性使用虽可最大限度地降低每个培养单元之间及批间差异，保证细胞和病毒产量及质量的稳定性和一致性［13-14］，但也增加了疫苗生产单位的成本，因此有必要寻求既能保证产品质量稳定性又能保证最小批间差异的培养容器。

本实验分别使用细胞工厂A 组（无锡耐思生物科技有限公司）和细胞工厂B 组（美国康宁公司）在10%、8%和5%的血清浓度下培养人二倍体细胞，并对病毒收获液和疫苗原液进行病毒滴度检测及稳定性考察，结果表明，人二倍体细胞KMB17 在两种细胞工厂中均能良好生长；两种细胞工厂在细胞培养基血清浓度为5%时制备的病毒收获液和疫苗原液感染性滴度明显优于10%和8%血清浓度的培养基；在 4 ℃放置 14 d、37 ℃放置 7 d 后，两种不同厂牌细胞工厂制备的病毒收获液和疫苗原液病毒滴度差异无统计学意义（P ＞0.05）；对两种不同厂牌细胞工厂制备的3 批病毒收获液和疫苗原液进行安全性指标检查，结果均符合《中国药典》三部（2020 版）相关要求［15］。

综上所述，使用不同厂牌细胞工厂在细胞培养阶段使用5%血清浓度即可获得生长状态良好的细胞，腮腺炎病毒SP-A 株在人二倍体细胞KMB17 中能够良好地增殖，病毒培养至7 d 可获得高滴度的病毒收获液，A 组和B 组细胞工厂均可用于制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗。本实验结果为以人二倍体细胞为基质的F 基因型腮腺炎减毒活疫苗规模化生产提供了实验依据。