Cu含量对磁控溅射Ti-Cu纳米复合涂层抗菌性能的影响*

程培雪，马 迅，李 伟，刘剑楠，刘 平，王静静，陈田田，杨 旭，滕海森

(1. 上海理工大学 材料与化学学院，上海 200093；2. 上海交通大学 医学院附属第九人民医院，上海200011)

0 引 言

随着种植技术的日趋成熟，种植修复已成为牙周疾病或外伤导致失牙的重要治疗手段。因此，对口腔种植材料的需求也在增加。而钛金属作为种植体的首选材料，具有良好的生物相容性和机械性能，但由于钛本身不具有抗菌性能，所以存在细菌感染发生率高等问题[1]。因此，通过对钛种植体表面改性处理，使其获得良好的抗菌性能具有十分重要的意义。

为了使钛植入体表面获得良好的抗菌性能，表面改性技术特别是涂层技术成为一种有效的策略。多种多样的涂层例如负载抗生素涂层[2]、抗粘附的涂层[3]、负载纳米抗菌涂层[4]等迅速发展。然而，负载抗生素具有疗效不稳定、释放速率难以控制、细菌产生耐药性等问题，而抗粘附涂层很难准确地评估其在体内临床条件下的有效性，因此在很大程度上限制了其应用[5]。相比之下,负载纳米抗菌涂层如金属系涂层的抗菌效果则更加稳定[6]。

铜作为金属系抗菌剂是人体所需的微量元素之一，而且价格低廉，适量的铜无细胞毒性，并且有一定的抗菌性能[7-9]，在医学领域作为抗菌剂引起越来越多的关注。制备纳米铜涂层的方法有很多，例如物理气相沉积法(PVD)、化学气相沉积法(CVD)、金属有机化合物热分解法、液相化学还原法、水热法等。其中磁控溅射作为物理气相沉积法具有所需设备少、成膜速率高且均匀性好，涂层与基体之间具有较强的结合力等优点[10]，在实际生产中应用较为广泛。

近年来铜抗菌材料的研究也受到了越来越多的关注。Liu等[11]针对纯Ti与Ti-Cu合金种植体做了对比，结果表明Ti-Cu合金对变形链球菌和牙龈卟啉单胞菌的抗菌效果更佳，并做了细胞的增殖和粘附实验，发现Ti-Cu合金的生物相容性与纯Ti类似。李慕勤等[12]在环境温度为50 ℃的情况下，在试样表面镀铜3 min，通过实验测试发现铜涂层的抗菌率达到98.3%，抗菌效果非常明显。Heidenau等[13]基于凝胶-溶胶法在Ti合金表面制备了Cu-TiO2涂层，抑制了表皮葡萄球菌在钛合金表面的增殖，且对大鼠结缔组织成纤维细胞的生长没有明显的影响。韦春贝等[14]利用双靶磁控溅射在不锈钢表面制备了TiN/Cu-Zn涂层，并研究了多层结构对膜层耐腐蚀性能和抗菌性能的影响。结果表明，Cu-Zn层比较薄时，膜层的耐腐蚀性能比较好，抗菌性能对TiN层厚度较为敏感；随着Cu-Zn层厚度的增加耐腐蚀性能显著下降，而当Cu-Zn层较厚时，抗菌性能对TiN层厚度不敏感，均具有良好的抗菌性能

Cu是动物和高等植物中必不可少的微量元素且具有良好的抗菌活性，然而，铜过量时又具有较高的毒性，影响正常细胞生长。因此，本文采用磁控溅射法在纯Ti表面制备不同纳米Cu含量的Ti-Cu复合涂层，研究纳米Cu含量对Ti-Cu复合涂层表面形貌、粗糙度、疏水性、细胞毒性和抗菌性能的影响，在符合生物安全材料标准的情况下提高钛种植体的抗菌性能。

1 实验材料和方法

1.1 样品制备与分组

本文利用磁控溅射仪(JGP-450，沈阳科学仪器有限公司)在纯Ti基体上制备Ti-Ag纳米复合涂层。选用直径50 mm，厚度3 mm，纯度99.99%的Ti靶和Cu靶，并切成6块，然后将不同块的Ti靶和Cu靶拼接成一个整体，使用该方法拼接成具有不同面积比的Ti-Cu复合靶，Cu∶Ti的比例分别为1∶99、2∶98、3∶97、4∶96和5∶95，如图1以5∶95为例。基体为纯Ti片，直径10 mm，厚度1 mm，用800#、1000#、1200#、1500#、2000#的耐水砂纸对Ti片进行抛光打磨至镜面，在超声震荡机内利用丙酮、无水乙醇以及去离子水进行超声清洗各20 min，然后自然晾干。

利用磁控溅射仪溅射之前，需对磁控溅射仪抽真空，直至真空度低于5×10-4Pa，通入Ar，设置压强，启辉，预溅射15 min左右，除去靶材表面残留的杂质。在溅射功率为40 W，溅射气压为0.8 Pa，氩气流量为30 mL/min下溅射1.5 min，制备不同Cu含量的Ti-Cu纳米复合涂层，实验流程图如图2。根据复合靶中Ti和Cu面积比的不同将涂层组分为Cu-1组、Cu-2组、Cu-3组、Cu-4组、Cu-5组。

图2 实验流程图Fig.2 Experimental flow chart

1.2 样品表征

使用场发射扫描电子显微镜(SEM，Quanta FEG450，FEI公司)观察样品的表面形貌；X射线衍射仪(XRD，D8 Advance，Bruker公司)分析样品物相，测量范围30～80°；采用原子力显微镜(AFM，Dimension Icon，Bruker公司)观察各组样品的三维形貌同时进行粗糙度的测量；使用界面张力测量仪(JC2000C1，上海中晨数字技术设备有限公司)进行水接触角的测量，用量角法测量样品不同位置的水接触角，每组分别测量5组平行数据，最后计算出每组数据的平均值，所有测试均在室温下进行。

1.3 体外细胞毒性试验

按照MEM培养基：马血清为9∶1的比例配制细胞完全培养基，所有样品均为固体，每组样品均用含量为75%的酒精棉球进行擦拭，然后用无菌去离子水对样品进行3次冲洗，最后将样品放置于37 ℃保温箱内进行烘干。将各组样品放入无菌平皿内并做好标记，转移至超净台(SW-CJ-2FD，上海笃特科学仪器有限公司)内，通过紫外线照射对样品进行2 h的杀菌，然后把样品放到新的无菌离心管内，同时做好标记。按照10 mL∶1 cm2的比例加入完全培养基，放入37 ℃ CO2恒温细胞培养箱(WIGGENSWCI-180，北京桑翌实验仪器研究所)72 h，制备成浸提液。此为母液，4 ℃保存备用。

选取对数生长期的小鼠成纤维细胞(L929，上海赛百慷生物)，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照6×103/孔的比例在96孔板中进行接种。总共分为9个组别，依次为：空白对照组(纯高糖培养基)、阳性对照组(苯酚)、阴性对照组(聚乙烯)、Ti组、Cu-1组、Cu-2组、Cu-3组、Cu-4组、Cu-5组。在5%CO2，37 ℃恒温培养箱中培养过夜，培养24 h后丢弃上清液，按照100 mL/孔加入浸提液，在24 h、48 h、72 h后停止细胞的培养，避光条件下，每孔各加入10 mL CCK-8试剂(Invigentech，货号：IV08-100)，并于5%CO2，37 ℃恒温培养箱中培养2 h。通过酶标仪(TECAN，型号：SPARK 10M)检测细胞在450 nm处的吸光度值OD。根据式(1)计算细胞相对活力(relative growth rate，RGR)，根据表1判断样品的毒性等级和安全标准。

(1)

表1 细胞RGR判断其毒性等级与安全标准

1.4 外抗菌实验

该实验采用的细菌为具核梭杆菌，采用脑心浸液肉汤(BHI)琼脂平板培养，然后在标准厌氧条件下(80%N2、10%H2、10%CO2，37 ℃)培养24 h，传代、稀释培育后，选取浓度值为106CFU/ml菌液，备用。将前述制备的样品用75%的酒精棉球擦拭，然后用去离子水冲洗试件3遍，37 ℃保温箱内烘干。将各组样品经紫外线照射杀菌2 h后，转移到新的无菌平皿内并标记。将灭菌后的样品与具核梭杆菌共培养24 h后，置于1 mLPBS中，轻振使样品上粘附的细菌脱落，然后将菌液稀释105倍，接种于新的BHI琼脂培养基中并做好标记，将标记好的培养基放置于厌氧箱中，然后抽真空，充入CO2混合气，37 ℃恒温孵箱内厌氧培养48 h后，对具核梭杆菌进行拍照计数，通过计数结果计算各样品抗菌率。

(2)

式中：R为抗菌率，%；A为实验组样品平均回收菌落数，cfu/片；B为纯Ti对照组样品平均回收菌落数，cfu/片。

2 结果与讨论

2.1 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层微观形貌的影响

不同Cu含量的Ti-Cu纳米复合涂层的SEM图如图3，由图3可见，Ti片表面比较光滑，而涂层组样品表面分布有纳米级颗粒。随着Cu含量的增加，Ti片表面颗粒也越来越多。图4为各涂层组样品的XRD图，从图中可知没有Cu相产生，说明Ti-Cu纳米复合涂层中Cu含量过少，且Cu的尺寸为纳米级别的，显示不出来。在衍射角2θ为76.1°附近出现了Ti的衍射峰。根据图4与标准图谱对照结果，可以得知为Ti(112)晶面。

图3 不同纳米Cu含量涂层的SEM图(a)Ti、(b)Cu-1、(c)Cu-2、(d)Cu-3、(e)Cu-4、(f)Cu-5Fig.3 SEM images of coatings with different nano Cu content: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

图4 不同纳米Cu含量涂层的XRD图谱Fig.4 XRD patterns of coatings with different nano Cu content

2.2 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层粗糙度的影响

图5和图6分别为AFM分析的三维形貌和表面粗糙度。如图5所示，Ti组和涂层组的三维形貌有很大差别。Ti对照组表面如图5(a)比较光滑，无颗粒状结构。而涂层组表面被均匀分布的Ti/Cu颗粒所覆盖。由图6可知，纯Ti表面粗糙度Ra为1.12±0.18 nm，涂层组表面粗糙度Ra相对于纯Ti对照组有明显地增加，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。并且随着Ti-Cu涂层中纳米Cu含量的增加，涂层组的粗糙度也按照Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5的顺序依次在增加，粗糙度值分别为5.16±0.40 nm、8.45±0.90 nm、10.45±0.70 nm、13.70±0.80 nm、16.1±s0.75 nm，其中Cu-5组粗糙度最大。

图5 样品表面AFM形貌：(a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5Fig.5 AFM morphology of sample surface: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

材料表面粗糙度是影响微生物粘附的一个主要因素[15]。粗糙的种植体表面有利于细菌粘附，而光滑的表面可以减少细菌粘附[16-18]。然而，近年来研究发现，表面粗糙度与细菌粘附[19]的数量并不是正相关的。Bollen等[20]研究了粗糙度与细菌粘附的关系，结果表明，Ra>0.2 μm时，表面粗糙度的增加可以促进细菌粘附，而Ra<0.2 μm时，细菌的粘附不随粗糙度的变化而变化。本实验中原子力显微镜(AFM)分析结果表明，涂层组表面的粗糙度虽然都有所提高，但所有样品的表面粗糙度均保持在0.2 μm以下，所以，本实验中各组样品的表面粗糙度对细菌粘附的影响不大。

图6 不同纳米Cu含量涂层的粗糙度Fig.6 Roughness of coatings with different Cu content

2.3 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层疏水性的影响

图7为各样品的水接触角。一般认为，水接触角小于90°时该表面具有亲水性，表面自由能高；水接触角大于90°时该表面具有疏水性，表面自由能低[21-22]，植入材料的疏水性对细菌的粘附以及生物膜的形成都有一定的影响，尤其影响细菌在其表面的初始粘附。通常亲水性的表面比疏水性表面更有利于细菌粘附和增殖[23]。本实验中，由图7可知，对照组纯Ti的水接触角为80.67°±0.82°，与对照组相比，各镀Ti-Cu纳米复合涂层组样品表面的水接触角均增大，且差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。随着纳米Cu含量的增加，水接触角增加，Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5组涂层的水接触角分别为95.58±0.92°、98.17±0.62°、100.33±0.51°、103.17±0.85°、107.42±1.23°。

图7 不同纳米Cu含量涂层的水接触角Fig.7 Water contact angle of coating with different Cu content

2.4 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层细胞毒性的影响

图8和表2分别是细胞吸光度值OD、RGR及细胞毒性等级结果。由图8可知，在24，48，72 h 3个时间点，纳米Cu涂层组、Ti组、阴性对照组的OD值与空白对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，对比阳性对照组在所有时间点与其他实验组的OD值，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。

表2 各组L929细胞培养不同时间的RGR与细胞毒性等级

大量的研究表明，纳米Cu具有细胞毒性和遗传毒性。纳米Cu的细胞毒性受到多种因素的影响，例如纳米Cu的大小，形状，浓度等。通常纳米Cu的浓度越高，其细胞毒性越大，甚至可以导致细胞死亡。本实验通过CCK-8法检测各组样品的细胞毒性，结果表明，阴性对照组、Ti组和各纳米Cu涂层组细胞相对活力均大于90%，毒性等级为Ⅰ级，未表现出明显的细胞毒性，符合生物安全材料的标准。这是由于涂层组样品有较少的Cu，从而未表现出细胞毒性。

本实验结果表明抗菌结果表明，通过磁控溅射技术在纯钛表面沉积的Ti-Cu纳米复合涂层具有明显的抗菌作用，并且Cu含量越高，涂层的抗菌效果也越好。虽然人们对Cu的抗菌机制已经有长期的研究，但是关于其抗菌机制也没有统一定论，目前大家公认的主要有以下两种理论：

2.5 不同Cu含量对Ti-Cu纳米复合涂层抗菌性能的影响

图9为个样品表面细菌培养计数结果，如图9所示，经过一定时间的培养，样品表面的菌落在琼脂平板上生长。结果表明，细菌在Ti组样品表面存活良好，稀释后涂覆到平板中在培养基表面大量繁殖，培养基的表面出现大量菌落，表明Ti组表面没有杀菌作用。对应载Cu涂层组的培养基中菌落明显减少。样品的抗菌率见表3，以对照组Ti组的细菌存活率100%为标准，Cu-1、Cu-2、Cu-3、Cu-4、Cu-5组样品表面的抗菌率分别为83%、85%、 89%、93%和95%，表明Cu元素的加入使材料获得抗菌性能，且对具核梭杆菌具有较强的抗菌作用，随着纳米Cu含量的增高，抗菌效果也越好，Cu-5组抗菌率最高，达到95%。

图9 各样品表面细菌培养计数结果 (a)Ti、(b)Cu-1、(c)Cu-2、(d)Cu-3、(e)Cu-4、(f)Cu-5Fig.9 Counting results of bacterial culture on the surface of each sample: (a)Ti, (b)Cu-1, (c)Cu-2, (d)Cu-3, (e)Cu-4, (f)Cu-5

表3 具核梭杆菌菌落计数(±s，n=3)及抗菌率(%)Table 3 Colony count and antibacterial rate of Fusobacterium nucleate

(1)铜离子释放杀菌

铜离子表面带正电荷，对于细菌而言，细胞膜表面带负电荷。当受到静电引力作用时，铜离子很容易吸附在细菌细胞膜上，且一步步透过细胞壁穿入细菌内部，和相关的酶、蛋白质等产生一定的化学反应，进而达到破坏核酸和DNA合成的目的。通过以上过程铜离子可以干扰细菌的正常功能，影响其内部pH值，使其无法正常分裂繁殖，也即达到了消灭细菌或抑制细菌增殖的目的[24-25]。

(2)接触杀菌

有研究发现，含铜涂层中未析出的铜离子也会有一定的抑菌效果[26]。当细菌与材料表面的铜涂层接触时，涂层中含的铜离子和细菌表面发生反应，导致细菌的细胞膜破损，进而造成细菌停止呼吸，细菌活性丧失，进而完成杀菌或抑菌[27-28]。也有研究表明，接触式的杀菌与细菌细胞膜内部的不饱和脂肪酸的ROS催化反应有关，ROS可以干扰细菌生存所必需的一些基本成分活性，导致细菌死亡[29]。

3 结 论

基于磁控溅射技术，在纯Ti表面镀Ti-Cu纳米复合涂层，对其微观结构和理化性质进行了表征，并通过细胞毒性实验和抗菌实验对样品的生物相容性和抗菌性能进行评价。研究得出以下结论:

(1)利用磁控溅射技术，在纯Ti表面成功沉积Ti-Cu纳米复合涂层，并且随着涂层中纳米Cu含量的增加，涂层表面粗糙度和水接触角均依次增大，Cu-5组的粗糙度和水接触角均最大，分别为(16.10±0.75)nm和107.41°±1.23°。

(2) CCK-8法检测细胞毒性结果表明，Ti-Cu纳米复合涂层改性的纯Ti未表现出明显的细胞毒性，各组材料的毒性等级均为I级，符合物安全性材料的标准。

(3) 体外抗菌实验结果表明Ti-Cu纳米复合涂层改性的Ti植入材料对具核梭杆菌抗菌率均达到80%以上，有较强的抗菌作用，并且随着纳米Cu含量的增加，涂层的抗菌性也越好，Cu-5组抗菌性最好，抗菌率高达95%。