长沙市非洲猪瘟病毒核酸检测实验室现状调查

郑姣妹，李本睿，廖书漪，彭嘉安，郑佳，何瑜，谭丹，陈智，赖诗嘉，唐爱明，王洪亮

（长沙市动植物疫病预防控制中心，湖南长沙 410000）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪或野猪引起的烈性传染病[1]。自2018 年8月我国首起ASF 疫情发生以来，其在全国范围内快速蔓延，使生猪养殖业遭受重创[2]。为响应农业农村部防控政策，各地严格落实属地防控责任，动物疫病预防控制机构（下称疫控机构）、第三方检测机构以及养殖、屠宰企业纷纷设立实验室开展ASFV 检测，在阻击疫情扩散、打赢ASF 防控歼灭战上发挥了关键作用。但随着检测工作持续运行，各类ASFV 检测实验室在检测水平、生物安全管理等方面的问题日益凸显[3]。

根据湖南省农业农村厅印发的《关于开展2019 年全省兽医实验室与非洲猪瘟检测实验室检测能力比对的通知》等文件要求，长沙市通过问卷调查、能力比对、实地调研的方式，2019—2021年连续对基层实验室ASFV 检测工作开展情况调查，发现存在的问题并提出整改意见，力求完善实验室检测人员队伍建设、提高检验检测能力、提升生物安全管理水平，为长沙市乃至湖南省的ASF防控工作做好技术支撑。

1 基本情况

1.1 实验室构成情况

通过问卷调查，长沙市具有ASFV 检测能力的实验室共30 家。主要分为3 类：一是疫控机构ASFV 检测实验室共6 家，包括省级1 家、市级1 家、区县级4 家，为各级疫控系统在原有兽医实验室基础上增加ASFV 检测项目，并通过湖南省动物疫病预防控制中心组织的ASFV 能力验证，确认具备ASFV 检测能力。二是企业ASFV 检测实验室，包括屠宰企业、养殖企业、饲料企业，共18 家。其中，屠宰企业6 家，均按农业农村部文件要求配备ASFV 检测实验室，覆盖率达到100%，生猪养殖企业9 家，饲料企业3 家，是企业根据农业部文件要求自行设立的实验室。三是第三方检测机构2 家、长沙市海关技术中心生物安全实验室1 家、以及科研院所2 家，其中2 所高校兽医实验室在2020 年前曾经开展ASFV 实验室检测，2021 年后取消相关检测项目。实验室的组成比例和区域分布见图1。

1.2 硬件设施设备情况

根据《关于规范湖南省非洲猪瘟检测实验室资格确认》文件规定，屠宰企业实验室面积不少于50 m2，养殖企业、第三方实验室面积不少于100 m2。根据对长沙市ASFV 检测实验室面积调查统计，实验室平均面积为244.1 m2。其中疫控机构和第三方检测机构实验室面积均超过基本要求，但部分屠宰、养殖企业实验室面积不足，尤以屠宰企业ASFV 检测实验室平均面积仅为42.7 m2（图2），未达到文件规定的最低面积要求。

图1 长沙市ASF 检测实验室构成情况

在仪器配备方面，疫控机构和第三方检测机构实验室配备仪器较齐全，除必备的荧光PCR 仪、核酸提取仪、生物安全柜和高压灭菌锅等主要仪器外，还具备酶标仪、纯水仪等，可开展各种病原和抗体的检测。屠宰和养殖企业实验室多采用与试剂配套的恒温荧光PCR 仪，方法简单易操作。

图2 不同类型ASFv 检测实验室平均面积

1.3 实验室检测试剂和方法情况

农业农村部要求ASFV 检测实验室采用的检测试剂盒，必须经农业农村部或中国动物疫病预防控制中心比对符合要求。经调查，长沙市30 家ASFV 检测实验室均采用具备农业农村部批准文号的ASFV 检测试剂盒或者国家标准方法，无采用试纸条检测情况[4]。其中屠宰和养殖企业实验室出于时效要求，多采用无需提取病原核酸的快速恒温荧光PCR 检测方法，主要使用青岛立见、明日达、普莱柯等公司产品，且未见使用超出使用期限的过期产品；疫控机构实验室则采用先提取病原核酸，再进行荧光定量PCR 检测的方法，以保证检测结果敏感性、特异性。

1.4 人员情况

全市共有检测人员106 人，年龄分布主要集中在20～50 岁，共有101 人，占总人数的95%，其中以30～40 岁人员最多，占总人数的42%（图3），年龄大于50 岁的多为实验室负责人。实验人员基本固定，都未在本实验室以外开展检测活动。疫控机构、第三方检测机构兽医实验室都配备了4 名以上检测和管理人员，且都具备兽医或检测相关专业知识。但屠宰和养殖企业实验室人员配备参差不齐：一是数量少，部分企业实验室仅配备1 名检测人员，且为未经专业培训的临聘人员，未设置检测复核人员，难以保证检测结果正确性；二是非专业兽医或检测相关专业人员占比低（图3），多数检测人员存在理论知识不足，对检测工作原理和生物安全知识缺乏认识，个人主动防护意识和应对紧急突发事件能力不足等情况；三是缺培训，多数检测人员具有由仪器厂家或试剂公司组织的操作培训经历，但缺乏系统培训，90%以上企业实验室不能提供培训记录资料，尤其是法律法规、生物安全培训记录。

图3 长沙市ASF 检测人员组成结构

1.5 检测能力比对情况

2018—2021 年，长沙市共有27 家ASFV 检测实验室参加了由湖南省动物疫病预防控制中心组织的ASF 检测能力比对。每次申请参加比对的实验室均有不同，符合情况也各有差异，其中除2018年第一次参加比对的实验室较少外，申请参加比对活动的实验室数量逐年递增（图4）。2020 年、2021 年参加比对的实验室为18 家，个别实验室因客观原因取消ASF 病原检测项目。各次能力比对结果中，大部分ASFV 检测实验室能通过能力验证，仅少数企业实验室单次验证结果不符。

1.6 生物安全管理情况

长沙市疫控机构、海关系统、第三方检测机构和部分企业自建ASFV 检测实验室能按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》要求，在市级兽医主管部门登记备案，其他类型实验室尤其是县级以下屠宰、养殖、饲料企业兽医实验室，无备案登记手续，其生物安全工作情况也未报备到县级兽医主管部门。

图4 长沙市ASF 检测实验室能力比对情况

疫控机构、海关系统均按照《兽医实验室生物安全管理规范》《检验检测机构资质认定能力评价通用要求》设置了生物安全组织管理框架图，明确实验室设立属性和功能，确立各岗位责任人员和管理人员职责，建立与实验室相适配的生物安全管理体系文件和制度[5]。屠宰、养殖和饲料等企业虽按照农业部文件要求设立相应实验室，但企业负责人和实验室管理人员未经专业培训指导，对实验室生物安全相关管理规范，以及生物安全管理体系文件具体要求缺乏了解，难以对其操作的病原微生物，以及从事的检测工作进行风险评估，除此之外，还存在实验室未建立生物安全防护方案和意外事件应急处理预案等情况。由于检测人员生物安全意识不足，导致部分实验室在样品管理、废弃物处理、档案记录、个人防护方面难以做到符合生物安全相关规定。

2 存在问题

2.1 硬件软件建设不全

实验室布局规划，须着重考虑消除或减少实验室安全风险，对通道、出口、实验室功能分区都有严格要求。此外，还需建立科学的供电供水、通风换气、安全隔离系统。屠宰、养殖等企业自建实验室受建筑面积限制，往往实验室布局单一，功能区域划分不全，易造成实验环境污染而影响检测结果。样品、污染物在洁净区和污染区来回流动也易造成实验室交叉污染。除实验室布局问题，部分企业实验室还存在环境消毒记录不完善、仪器使用记录不及时、仪器老化、缺乏定期检查和维修等问题。

2.2 生物安全管理滞后

一是实验室生物安全体系制度不健全，尤其是人员准入制度、个人安全防护制度等。调查结果显示，仅有53.33%（16/30）的ASFV 检测实验室建立了完善的生物安全体系制度，能在运行中严格按照制度运行的实验室又在少数。在生物安全管理方面，多数检测人员对生物安全管理体系文件要求不熟悉，实验室无生物安全防护方案，无意外事件应急处理预案，无病原微生物危害评估，无应对突发意外事件的措施和相关准备。二是实验室生物安全防护装备配备不齐全。调查结果显示，虽有60.00%（18/30）的ASFV 检测实验室同时配备了生物安全柜和高压灭菌锅，但存在高压灭菌锅年久失修、生物安全柜使用不规范问题，存在一定生物安全隐患。三是实验室生物安全标识设置不规范，相关仪器上未粘贴“当心高温”“当心冻伤”“当心灼伤”等警示标识，存在造成实验室操作人员冻伤、灼伤或者化学伤害的风险。

2.3 实验人员能力欠缺

实验室检测人员素质是维持实验室正常运转的重要因素。调查显示，疫控机构实验室相对企业实验室人员配备更加充足，且学历水平更高，专业对口性更强。不少屠宰企业ASFV 检测实验室仅配备1 名大专以上、非兽医专业的实验人员，这不符合《关于规范湖南省非洲猪瘟检测实验室资格确认》文件中“需具备大学专科以上兽医相关专业技术人员不少于2 名”的规定。另外，不少企业自建实验室的检测人员缺乏相关专业知识及必要的岗前培训，仅会操作仪器，不具备解决检测中遇到特殊问题和突发情况的能力，无法正确分析和判断检测结果。因此，长沙市ASFV 检测人员的整体专业素质仍有较大提升空间。

2.4 检测结果准度存疑

调查发现，部分ASFV 检测实验室存在诸多影响检测结果准确性的情况。如：价格因素，使用无需提取病原核酸，直接进行扩增的检测试剂盒；检测过程不设立阳性对照；检测不按照说明书要求操作；待检样品、已检样品和检测试剂盒混放，样品和试剂相互污染；未按要求保存样品导致样品变质失效等[6]。部分ASFV 检测实验室接样台账信息缺失，无法溯源已检样品；样品无唯一性标识，易混淆各批次样品，难以保证检测结果与实际样品相符。

3 有关思考

3.1 加大经费投入，推进设施建设

各机构应提高对实验室建设的重视程度，加大资金投入力度，按照兽医实验室生物安全建设标准建设符合标准的兽医实验室；改善实验室环境，合理布局；配备足量生物安全柜、高压灭菌锅、洗眼器等相关仪器设备。无论是疫控机构、实验室还是企业自检实验室，都应做好财政预算，科学分配资金用于实验室基础设施建设、仪器设备更新维护、实验室试剂耗材采购及实验室运行管理。

3.2 增强监管力度，落实主体责任

各机构应加强兽医实验室管理，按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》规定，对一、二级动物病原微生物实验室加强管理，建立健全规章制度，保证实验室生物安全；新建、改建或者扩建一级、二级实验室，应当向设区的市级农业农村主管部门备案。县级农业农村主管部门要按照农业农村部和省农业农村局有关要求，每年至少开展一次病原微生物实验室生物安全专项检查工作，排查风险隐患，及时处置化解。企业内部应经常开展实验室生物安全自查工作，加强日常管理，对实验室管理运行、检测仪器、环境条件、人员资质、样品处置、检测方法、试剂管理等方面进行细致的检查，及时保存各项检查记录，对检测环节可能出现的生物安全风险进行评估，采取有效措施，预防生物安全风险事故的发生。

3.3 扩充检测队伍，提高人员素质

各机构应制定具体培训方案，组织人员参加生物安全和法律知识培训，学习《生物安全法》《动物防疫法》《病原微生物实验室生物安全管理条例》等法律法规和实验室生物安全相关知识，培养一批基础知识扎实、实际操作能力强、有责任心的实验室专职检测人员。同时，企业应适度提高检测人员薪资待遇，招聘与岗位需求匹配度高的兽医专业检测人才，多开展业内人员的技术交流，提高检测人员整体素质。

3.4 筑牢技术支撑，优化服务指导

市级疫控机构作为技术支撑单位，需认真贯彻落实好《生物安全法》具体要求，积极组织开展专项兽医实验室生物安全检查，帮助县级基层实验室发现问题，解决问题。在开展实地调研之外，应积极组织实验室人员进行生物安全管理培训，提高实验室人员专业素养和技术力量。同时，县级农业农村主管部门加强对辖区内实验室生物安全监管，动物疫控机构指导帮助企业类型实验室根据自身实际情况，编排完善《生物安全管理手册》《质量手册》等体系文件和管理制度，提高其生物安全管理水平。各实验室还需加强与海关、高校等部门协调合作，共同推进ASFV 检测实验室规范化、标准化，为养猪业发展保驾护航。