鸭星状病毒3 型RT-RAA 快速检测方法的建立

邓春冉，张富友，尚佳静，罗娟，于晓慧，蒋文明，刘华雷，王一新，刘冠慧，徐丽娜，李阳

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山东农业大学动物医学院，山东泰安 271018）

禽星状病毒（avian astrovirus，AAstV）属于星状病毒科，包含多种亚型，是危害家禽养殖业的重要病原之一。AAstV 是一种无囊膜的单股正链RNA 病毒，直径25～35 nm，基因组全长6.1～7.9 kb，包括5'端非编码区、3 个开放阅读框（ORF1a、ORF1b 和ORF2）、3'端非编码区和1 个多聚腺苷酸尾巴[1]。鸭星状病毒（DAstV）是最早被发现的AAstV，早在1965 年研究人员就从患病毒性肝炎的鸭群中发现了DAstV。目前，已知的DAstV 基因型有4 种（DAstV-1～4）[2-4]，其中DAstV-3 是近年来在我国鸭群中感染率较高的星状病毒，流行的范围也越来越广，可以引发鸭病毒性肝炎、产蛋下降等，给我国养鸭业带来了严重经济损失[5]。

目前，对于DAstV-3 的检测主要依靠传统RT-PCR、荧光RT-PCR 和血清学检测等方法，但这些方法耗时长，对设备要求较高，并不适用于DAstV-3 的现场快速检测。重组酶介导的等温扩增技 术（recombinase aided amplification，RAA）是一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶，在恒温条件下进行核酸扩增的新技术，相比于传统的PCR 检测方法，具有快速、简便、灵敏等优点，目前已被应用于乙型脑炎病毒[6]、新型冠状病毒[7]、鸡滑液囊支原体[8]等病原体的快速检测，在很大程度上为疫病防控提供了便利。本研究建立了一种DAstV-3 的RT-RAA 快速检测方法，以期为该病原感染临床快速诊断和流行病学调查提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 RT-RAA 核酸扩增试剂盒（荧光法），购自杭州众测生物科技有限公司；一步法RT-PCR 试剂盒（HiScript High Fidelity One step RT-PCR Kit），购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；病毒DNA/RNA 提取试剂盒，购自济凡生物科技（北京）有限公司；转录试剂盒（RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7），购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；纯化试剂盒（RNeasy Mini Kit），购自德国QIAGEN 有限公司；胶回收试剂盒，购自赛默飞世尔科技公 司；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit 和Trans5α Chemically Competent Cell，购自北京全式金生物技术（TransGen Biotech）股份有限公司；LB培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；DNA Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 主要仪器 RAA-B6100 恒温振荡混匀仪、RAA-F1620 恒温核酸扩增检测仪，购自江苏奇天基因生物科技有限公司；miniAmp PCR 仪、Nano Drop 核酸定量仪，购自赛默飞世尔科技公司；涡旋振荡器，购自上海沃元科技有限公司。

1.1.3 病毒及临床样本 DAstV、H9 亚型禽流感病毒（H9-AIV）、鹅星状病毒（GoAstV）、新城疫病毒（NDV）、禽呼肠孤病毒（ARV）等，均由中国动物卫生与流行病学中心分离鉴定并保存。鸭拭子和组织样品，采集自广东、广西、福建、湖南等地，共计166 份。

1.2 方法

1.2.1 引物、探针设计与合成 依据DAstV-3 参考毒株CPH 株（GenBank：KJ020899）基因序列，利用Oligo 软件设计探针和引物，序列详见表1。所有引物及探针均由生工生物（上海）有限公司合成。

1.2.2 cRNA 标准品制备 以提取的DAstV-3 RNA 为模板，使用AAstV 通用引物（XZ-F/R）扩增DAstV-3的RdRp基因，回收目的片段后连接到T 载体上，通过热激将重组质粒转化进大肠杆菌感受态细胞DH5α 中；筛选阳性单克隆菌落并进行培养，使用SpeI 内切酶对阳性质粒进行单酶切；使用胶回收试剂盒对酶切后的质粒进行纯化，选择合适浓度的纯化产物作为模板，使用T7 转录试剂盒进行体外转录，再使用RNeasy Mini Kit 纯化试剂盒对转录产物进行纯化，以除去体系中的杂蛋白和各种离子；使用Nano Drop 核酸定量仪测量cRNA标准品浓度，通过公式计算拷贝数，并将cRNA 标准品10 倍倍比稀释至100copies/μL，-80 ℃保存。

表1 引物探针序列

1.2.3 RT-RAA 方法建立及优化

1.2.3.1 引物筛选 以1.2.2 制备的cRNA 为模板，将表1 中的8 种上游引物和6 种下游引物分别进行组合（共48 对），挑选起峰时间早、扩增曲线斜率高的引物组合作为最佳引物对。按照荧光RT-RAA 扩增试剂盒说明书配制反应体系（表2），在含有冻干粉的反应管中加入47.5 μL 上述混合液，在管盖上加2.5 μL B-Buffer（280 mmol/L 乙酸镁），小心盖好盖子，置于恒温振荡混匀仪中振荡混匀，再转移到恒温核酸扩增检测仪中，39 ℃反应20 min。

表2 RT-RAA 反应体系

1.2.3.2 反应条件和反应体系优化 对RT-RAA的反应温度、引物探针用量等参数设置梯度，分别设置反应温度为37、39、41 ℃，引物用量为2.0、1.6、1.2、0.8 μL，探针用量为0.6、0.4、0.2 μL。对比不同条件下的荧光扩增曲线斜率，确定最佳反应条件，同时设置阴性对照。

1.2.3.3 特异性试验 使用优化的RT-RAA 方法，分别对DAstV-3、H9-AIV、GoAstV、NDV、ARV等常见禽病毒进行检测，以验证该方法的特异性。

1.2.3.4 灵敏性试验 以拷贝数浓度为106～100copies/μL 的cRNA 标准品为模板，使用建立的RT-RAA 方法进行检测，测定模板的最低检出量，从而确定该方法的灵敏性。

1.2.3.5 重复性试验 以106～100copies/μL 拷贝数浓度的cRNA 标准品为模板，RNase-free water为阴性对照，利用优化的荧光RT-RAA 方法进行试验，设置8 个重复，并统计重复试验结果。

1.2.4 临床样品检测 利用建立的RT-RAA 方法和RT-PCR 方法同时对采集的166 份临床样品进行检测，验证该方法的临床适用性。

2 结果

2.1 RT-RAA 反应体系建立

2.1.1 引物筛选 选择起峰时间早、扩增曲线斜率高的引物为最佳组合。从48 对引物中挑选7 对引物组合作图。结果（图1）显示：F8/R1 组合扩增效果最好，因此选用此组合进行后续试验。

图1 部分引物筛选结果

2.1.2 反应体系优化 分别选择不同反应温度（37、39、41 ℃）、不同引物用量（2.0、1.6、1.2、0.8 μL）和不同探针用量（0.6、0.4、0.2 μL）进行RT-RAA 试验，对比不同条件下的荧光扩增曲线斜率。结果显示：3 种探针用量对RT-RAA扩增结果影响不大（图2）；引物用量为2.0 μL和1.6 μL 时，RT-RAA 的扩增结果更好（图3）；3 种反应温度对RT-RAA 扩增结果影响不大（图4～6）。综合考虑试剂盒说明书要求和试验成本，最终确定引物用量为2.0 μL，探针用量为0.4 μL，反应温度为39 ℃。

图2 不同探针用量下RT-RAA 反应结果

图3 不同引物用量下RT-RAA 反应结果

图4 37 ℃条件下RT-RAA 反应结果

图5 39 ℃条件下RT-RAA 反应结果

图6 41 ℃条件下RT-RAA 反应结果

2.1.3 特异性试验 利用优化的RT-RAA 方法分别对DAstV-3、GoAstV、H9-AIV、NDV、ARV 进行检测。结果（图7）显示：只有DAstV-3 出现特异性荧光扩增曲线，其他病毒均未出现扩增曲线。

图7 特异性试验结果

2.1.4 灵敏性试验 以10 倍倍比稀释的cRNA为模板，利用优化的RT-RAA 反应体系进行检测。结果（图8）显示：建立的RT-RAA 方法最低检测限为101copies/μL。

图8 灵敏性试验结果

2.1.5 重复性试验 使用建立的RT-RAA 方法进行重复性试验。结果显示：以106～103copies/μL 的cRNA 标准品为模板，8 次检测均出现扩增曲线；以102copies/μL 的cRNA 标准品为模板时，8 次检测中有6 次出现扩增曲线；以101copies/μL 的cRNA 标准品为模板时，8 次检测中有3 次出现扩增曲线；以100copies/μL 的cRNA 标准品为模板时，8 次检测均为阴性。

2.2 临床样品检测

利用建立的RT-RAA 方法和RT-PCR 方法分别对166 份临床样品进行平行检测。结果（表3）显示：RT-RAA 方法检测到40 份阳性样品，RT-PCR 检测到22 份阳性样品，其中两种方法均检测为阳性的样品有22 份。为验证RT-RAA 方法的准确性，对RT-RAA 结果阳性但RT-PCR 结果阴性的样品进行测序鉴定，证实均为DAstV-3。结果表明，RT-RAA 方法检测结果准确可靠，且具有更高的阳性检出率。

表3 RT-RAA 和RT-PCR 方法临床样品检测结果统计单位：份

3 讨论

AAstV 是近年来新发现的一种重要病原，既可通过水平和垂直传播，也可跨物种传播，除可感染鸡、火鸡、鸭等禽类外，也可感染哺乳动物[10]，导致AAstV 感染的诊断与防控难度日益增大。作为一种潜在的人兽共患病毒，AAstV 对人类健康构成了严重威胁[11]。DAstV-3 在我国最早于2014年被发现并报道，其传播速度快，分布范围广，给我国养鸭业带来较大的经济损失[12]。目前，实验室常用的DAstV-3 检测方法主要有病毒分离培养、分子生物学检测、电子显微镜（EM）观察等[13]，但鉴于DAstV-3 的分离培养较为困难，常规检测耗时长且操作复杂，电子显微镜对仪器设备要求较高等原因，以上方法均无法满足DAstV-3 的快速和大规模检测需求。因此，开发一种快速、特异、灵敏、操作简单的检测方法至关重要。

RAA 技术是近年来快速发展的一种新型等温扩增技术。该技术利用大肠杆菌酶将模板核酸链解螺旋后，在重组酶、聚合酶作用下对模板核酸进行重组和特异性扩增。恒温条件下，RAA 技术在20～30 min 内即可完成核酸快速扩增，具有特异性强、成本低、耗时短及结果判读简单直观等优势，已在多种动物病原检测中被广泛应用，具有广阔的发展前景。DAstV-3 作为新发病原，目前尚未见RT-RAA 检测方法的报道。在此背景下，本研究建立了一种基于荧光探针的DAstV-3 RT-RAA 快速检测方法。

DAstV-3的RdRp基因编码病毒核糖核酸聚合酶，该基因序列在不同DAstV-3 毒株中较为保守。本试验首先分析了GenBank 中登录的DAstV-3RdRp序列，根据保守序列设计了特异性引物及探针，验证确定最佳引物后，对该方法的反应条件进行了优化，并对其灵敏度、特异性和重复性进行了验证。结果表明，本试验所建立的荧光RT-RAA检测方法仅需20 min 即可完成样品的快速检测，与常见的禽病毒无交叉反应，其最低检测限可达101copies/μL。为进一步验证该方法的临床应用效果，采用该方法检测166 份临床样品，发现荧光RT-RAA 方法的阳性检出率高于常规RT-PCR 方法。同时，检测结果也提示，DAstV-3 在我国鸭群中感染率可能较高，需要持续关注该病毒的流行及其带来的危害。

综上，本研究建立了一种DAstV-3 RT-RAA 快速检测方法。该方法特异性强，灵敏度高，操作简单，为开展DAstV-3 的快速检测及流行病学监测提供了可靠的技术支撑，具有良好的应用前景。