肝脏疾病的现代治疗方法

贾昊宇 杨长青

肝脏是一个重要的代谢中枢，在代谢中起着重要的作用，尤其适于新疗法的发展。在过去的10年中，开发出许多新的肝脏靶向性的治疗方法[1]。这些疗法提供DNA或RNA相关的遗传物质，以恢复或沉默关键的基因的表达。治疗范围不仅限于原发于肝脏的疾病，还包括代谢疾病，如高脂血症或病因源自肝脏的疾病，如血友病[2]、卟啉症[3]或原发性高草酸血症[4]。这些进展突出了以肝脏为靶点的分子方法治疗一些单基因疾病的治疗潜力，例如α-1抗胰蛋白酶缺乏症和肝豆状核变性(WD)，以期将获得的经验用于治疗更常见的疾病，如慢性HBV感染和非酒精性脂肪性肝病。本文综述总结了现有的肝脏靶向分子治疗方法。

一、mRNA疗法

mRNA疗法是一种新兴的治疗方法，该法一直是用于研究COVID-19疫苗的最前沿的方法[5]。mRNA疫苗与以减毒活病毒(如麻疹、腮腺炎和风疹)为基础的疫苗使用相同的宿主机制：mRNA被传递到宿主细胞并转化为病毒蛋白，被宿主免疫系统识别。目前批准的mRNA疫苗较为高效和安全[5]。虽然疫苗是mRNA类药物的理想应用，因为少量瞬时表达的mRNA就足以产生大量的蛋白质表达并引发免疫记忆，但合成mRNA药物的临床前景不止于此。扩展到可通过重新表达缺陷蛋白来治疗代谢相关疾病，以及使用抗体编码的mRNA取代基于蛋白质的单克隆抗体来对癌症进行个体化治疗。

由于mRNA在体内的快速降解、宿主对外源RNA的反应[6]和mRNA传递的困难，最初使用合成mRNA作为药物有很大的阻碍。核苷修饰是使合成mRNA能够用于临床治疗的关键进展之一，可提高蛋白质翻译和降低mRNA本身的免疫原性[7]。此外，脂质纳米颗粒(LNP)技术也是保护mRNA免受降解和介导细胞内传递的理想方法[8]。

尽管尚未批准将mRNA用于人类肝病的治疗，但目前已有临床前研究证明其在动物肝脏疾病模型上取得成功[9]。在再生医学领域，已发现mRNA介导的肝细胞生长因子和表皮生长因子的肝脏表达可诱导小鼠肝脏再生[10]。

二、基因添加

(一)不同类型的载体 在过去20年里，以肝脏为靶点的基因治疗已成为治疗单基因疾病的一个非常有潜力的选择，大量的相关研究和一些临床试验正在进行中。治疗目的是通过添加外源性DNA序列(基因添加)或修改患者基因组(基因编辑)来恢复目标基因的表达[1]。在许多可负载核酸到达肝脏的病毒和非病毒载体中，重组腺相关病毒载体(rAAV)是主要的候选载体[1]。rAAV具有较低的免疫原性和较低的整合能力，多数血清型具有较高的肝脏靶向性[11]。rAAV可在缓慢/未分裂细胞(如成年肝细胞)的细胞核中作用数年，在成人肝脏中表现出有利于基因转移的特性，但在儿童肝脏中不能实现持久的转基因表达，因为片断不会复制，并且在肝脏生长过程中会被稀释。且较难实施的是，在约40%的患者体内存在针对给定rAAV血清型的中和抗体(NAbs)，使这些患者排除在相应的临床试验之外[12]。此外，rAAV输注后发生NAbs中和使再注射和连续使用成功率降低，迫使更换新的血清型。针对以上问题，开发出使用整合rAAV的策略，此方法可以产生永久的转基因表达，甚至可能校正细胞的积极选择，然而，它具有更高的基因毒性风险[1]。可以通过使用(i)整合载体(如优化的慢病毒[13])或(ii)依赖于核酸酶(如CRISPR)、转座酶或无核酸酶的DNA模板(通过同源重组整合到内源性白蛋白位点)来实现[1,14]。在临床前研究中，整合基因已成功通过rAAVs或LNP转入肝脏[14]。虽然效果尚佳，但使用病毒载体有一定的风险，如下所述。

(二)免疫反应和肝毒性 尽管rAAV基因治疗显示出显著的疗效，但早期临床试验也突出了rAAV基因治疗的局限性。首先是免疫反应，特别是T细胞对衣壳和NAb产生的反应[1,15]。T细胞介导的免疫反应通常发生在输注后6～10周，表现为丙氨酸转氨酶的增加，可能导致转导后肝细胞的损伤，并与给药载体剂量成比例[2]。早期类固醇治疗可降低这种免疫反应，在随访中不会复发，因为它主要针对在初始阶段短暂存在的衣壳抗原[2]。

第二个局限是其遗传毒性。野生型(WT) AAV的Rep蛋白能够将病毒DNA整合到宿主基因组中[15]，在不存在已知危险因素的肝细胞癌(HCC)患者中已鉴定出野生型AAV2基因组的插入，表明其致癌作用[16]。与野生型AAV相比，rAAV输注后发生HCC的风险较低，因为包括Rep基因在内的所有编码序列都被去除。尽管如此，在临床前模型中发现，仍有发生随机基因组整合的风险(0.1～1%)[17]。

除了遗传毒性，临床试验中脊髓性肌肉萎缩或肌管性肌病(MTM)使用比血友病使用更高的载体剂量来实现肌肉靶向[>1014载体基因组(vg)/kg]，有报道提示该剂量可引起急性肝损伤[18]。需在纠正表型的适当载体剂量与潜在肝毒性和免疫反应的不良影响之间取得平衡，这些不良影响往往随着载体剂量的增加而增加。

三、基因组和表观基因组编辑

基因组或表观基因组编辑疗法是基因异常过表达或基因直接产生错误折叠蛋白质的疾病的理想应用。基因组编辑需要用核酸酶(如CRISPR-Cas9[1])对患者特定位点的基因组进行直接修改，或用核酸酶受损的Cas碱基编辑器[19]或引物编辑器[20]进行编辑。表观基因组编辑使用与各种效应蛋白融合的Cas蛋白来介导基因组重组、染色质环化或组蛋白和DNA的生化修饰[21]。

首次成功在镰状细胞病中体外使用CRISPR法的临床试验证明，通过基因编辑细胞的自体移植可以纠正造血干细胞疾病；最近的一种体内方法通过LNPs将Cas9 mRNA和guide RNA传递到肝脏来治疗TRR介导的淀粉样变，导致循环的TTR水平下降了90%[22]。其有效性证明，这种方法将为已批准的重复siRNA注射提供一种有价值的替代方法。但其存在潜在的遗传毒性、可能的脱靶效应以及可能导致大规模的染色体缺失[23]。此方法在人类患者的安全数据很少，毒性需要密切监测。

四、RNAi和ASO治疗法

用短的互补RNA片段加工和翻译mRNA是一个越来越常用的的治疗选择。使用这种机制的两种主要模式是siRNAs和反义寡核苷酸(ASOs)[24]。在鸡胚中首次证明了反义机制的有效性，合成的寡核苷酸阻断Rous肉瘤病毒RNA的翻译，从而抑制病毒复制[25]。ASOs由具有主链、糖和碱基特异性修饰的单链寡核苷酸(12～30个核苷酸)组成。它们的结构能够与血浆和细胞表面蛋白进行高亲和力的相互作用，从而在不需要其余配方或辅料的情况下促进其广泛分布到不同组织[24]。ASOs结合互补(pre-) mRNA，并在空间上阻碍蛋白质翻译。此外，ASOs的设计类似一个间隙，可容纳一个未修饰的DNA核心，通过RNase H1招募诱导RNA裂解和降解。目前批准的ASOs主要针对治疗杜氏肌营养不良、脊髓性肌肉萎缩等神经肌肉疾病，以及家族性乳糜小贫血综合征(FCS)。但由于治疗中仍有病例出现高甘油三酯血症甚至并发胰腺炎，可能会限制其治疗效用，因此，更应致力于提高ASOs的细胞靶向效应。在此基础上，使用N -乙酰半乳糖胺(Gal- NAc)偶联的ASOs，它可通过与唾液糖蛋白受体的高亲和力相互作用将ASO定向到肝细胞，并使其效力增加20～30倍[26]。使用这种方法需要更少的ASO剂量。

与ASOs相比，双链siRNA(19-22个碱基对)与细胞表面或血浆蛋白的相互作用不太明显，因此需要一种更活跃的传递机制。siRNA通过RNA诱导沉默复合物 (RISC)使其目标mRNA失活：双螺旋通过伴侣被载入到RISC中，在去除感觉链后，形成有活性的RISC。剩余的链作为与目标mRNA结合的向导，然后被RISC中的内切酶降解[25]。20年前报道了第一个成功的体外沉默[27]，但未修饰或仅简单修饰的siRNA分子稳定性较差且治疗效果不确定[25]。目前批准的基于siRNA的药物主要依赖于RNAi与GalNAc的结合，其后通过受体介导的内吞作用被内化并释放到细胞质中[28]。这些结合物的强组织特异性将不良事件的风险降到最低。此外，与静脉注射相比，GalNAc偶联物使用皮下注射后可获得更高的肝siRNA暴露，因为肝细胞表面有限的唾液糖蛋白受体无法内化静脉注射后过量的siRNA。

综上，肝脏作为蛋白质和脂质代谢中心枢纽的重要作用使其成为治疗肝脏相关疾病和全身疾病的靶点。使用rAAV载体的基因添加方法在血友病的III期临床试验中结果良好，目前正在对其在肝脏疾病中的疗效进行评估。肝细胞一直是基因沉默研究的主要焦点，因为它们很容易被特异性靶向，并且在多种疾病相关途径中发挥着关键作用。基因治疗策略具有改变现代医学的潜力，它们可以作用到小分子或治疗性抗体难以到达的靶点，以期在更多领域发挥其精准靶向治疗的作用。