微性状鉴别法鉴别紫锥菊

吕绪桢， 孙四海， 李俊强， 景奉堂， 张天屹， 冯 帅,4*， 李 峰,4*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.聊城市人民医院药学部，山东 聊城 252000；3.烟台市食品药品检验检测中心，山东 烟台 264000；4.山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心，山东 济南 250355)

紫锥菊来源于菊科植物松果菊属紫锥菊Echinaceapurpurea(L.) Moench的干燥地上部分[1]，在北京、山东、上海等多地引种。《美国药典》中将淡紫松果菊、狹叶紫锥菊和紫锥菊的根与根茎作为紫锥菊药材来源。国内紫锥菊多用于治疗鸡、鸭、猪等动物的病毒感染和提高动物的免疫力[2-3]。紫锥菊有强效的抗呼吸道合胞病毒作用[4]。紫锥菊原材料质量的不一致性导致产品质量的不稳定性[5]，临床前和临床研究并未证明产品之间的药理等效性[6-9]。因此，鉴别控制紫锥菊品种质量具有重要意义。

本研究利用常规摄影技术、微性状拍摄技术[10-14]、显微图影拼接技术及实时景深扩展成像技术对紫锥菊药材的微性状及显微特征进行彩色影像数据采集[15]，对16批紫锥菊进行生药学研究。

1 材料

间苯三酚(批号BR30443)、苏丹Ⅲ(批号XY21228)、水合氯醛(批号Q/12HB4218-2017)、菊苣酸(批号111752-201703)，上海源叶生物科技有限公司；浓硫酸、浓盐酸、丙三醇(批号GB687-77)；甲醇，美国赛默飞公司。

CX41RF显微镜(上海赖氏电子科技有限公司)；SZM-45 T体视显微镜(深圳市方特科技有限公司)；显微成像系统、WFH-203C四用紫外分析仪(上海驰唐实业有限公司)。

16批紫锥菊药材(两年生)经山东中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为菊科植物松果菊属紫锥菊Echinaceapupurea(L.) Moench的全草。新鲜药材均于盛花期采收后放于4 ℃冰箱保鲜，药材晒干后放于干燥通风避光处，见表1。

表1 样品信息

2 方法

2.1 微性状鉴别 利用高清体视显微镜对紫锥菊药材根、茎、叶、花部位的微性状特征进行观察，采用实时景深扩展与拼接成像技术进行拍摄，获取彩色影像数据[16-17]。

2.2 显微鉴别研究 取紫锥菊做定位徒手切片、刀挫粉末制片。经水合氯醛装片。利用间苯三酚和浓盐酸、浓硫酸、苏丹Ⅲ溶液、90%乙醇确定特征结构。采用大图影像拼接结合实时景深扩展成像技术进行拍摄，获取彩色影像数据。

2.3 理化鉴别

2.3.1 供试品溶液的制备 取紫锥菊药材粉末(过40目筛)2.5 g，加40%甲醇50 mL于250 mL具塞锥形瓶中，称重，超声30 min，离心，取上清液，作为供试品溶液(S1-S16)。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取1.00 mg菊苣酸，放置于1 mL棕色量瓶内，加入甲醇定容至刻度，混合均匀后备用，作为对照品溶液。

2.3.3 薄层层析 硅胶GF254薄层预制板在110 ℃中活化0.5 h，毛细管点样对照品溶液、供试品溶液各5 uL，分别点在活化好的预制薄层硅胶板上。以乙酸乙酯∶甲酸∶水(6∶0.5∶1)为展开剂，展开至9 cm，取出薄层板晾干后置365 nm紫外灯下观察。

3 结果

3.1 微性状鉴别

3.1.1 根微性状 主根呈圆锥状，长15～25 cm，直径1.5～3 cm，上部常有紫红色叶柄残基。棕褐色，粗糙，表面有黑色斑点，上部或全体有疏浅断续的紫黑色横环纹及纵皱纹深沟，侧根较发达，密生须根，有多数须根痕，须根上多有白色柔毛。质硬，易折断，断面粗糙，圆形，皮部棕黄色，其上常有空腔，含有橘黄色油状物，形成层环棕黄色，木部黄白色，靠近皮部可见黄棕色环状分泌物，多数点状导管小孔放射状排列，射线形成放射状纹理，表面偶见绿色。气芳香，味初甜而后苦，微麻舌。见图1。由表2可知，甘肃省、陕西省、安徽省根表面黑色斑点较少，白色绒毛密集，断面皮部空腔较少。而广东省根白色绒毛稀疏。山东省、河北省、河南省根表面黑色斑点较多，有明显的紫黑色横环纹及纵皱纹深沟，断面皮部含有较多空腔。

3.1.2 茎微性状 茎(图2)圆柱形，表面绿色，具纵向棱线，中部以上分枝较多，长50～100 cm，直径0.5～2 cm，被白色贴伏糙毛，表面具紫褐色或深绿色线性皮孔样纵向斑点。茎横切面类圆形，外被透明角质层。皮部墨绿色环列，木部淡绿色呈半月形环列，大小相伴排列，木部导管小孔径向排列，清晰可见，皮部与木部约占横切面1/4，干燥茎皮部与木部易分离。髓部呈白色，排列疏松,占横切面的3/4,外侧可见黄棕色斑点环列。气微、味淡。由表2可知，甘肃省、陕西省茎为浅绿色，白色贴伏糙毛密集，皮孔样纵向斑点少。其它产地茎为绿色，有白色贴伏糙毛，皮孔样纵向斑点较多。

3.1.3 叶微性状 茎生叶绿色或灰绿色，卵形至宽披针形，顶端渐尖，通常具稀疏锯齿，有的全缘，叶柄长0.5～1.5 cm。基生叶墨绿色细长，卵形或三角状卵形，长7～25 cm，宽2～7 cm，叶柄长5～25 cm。两种叶片上下表面及主脉均有白色直立的糙毛，下表面糙毛多于上表面。见图3。由表2可知，甘肃、陕西与安徽叶为绿色，锯齿明显，表面糙毛密集，而广东省叶表面糙毛稀疏。山东、河北、河南叶多为灰绿色，叶边缘具稀疏锯齿，少数全缘，叶表面具糙毛。

3.1.4 花微性状 花序顶生，头状花序(图4)呈放射状，舌状花基生于花托，8～21余朵，粉色或紫红色，狭长椭圆形，顶端2～3裂，全身被有稀疏不等的细密毛绒，花后期自基部向下折。花托圆锥形或圆盘形。总苞片盘状，覆瓦状排列，绿色或棕绿色，常为 5 层，披针形至卵状披针形，上表面近革质，下表面被有绒毛，中间数层先端外折。管状花托片龙骨状，宿存，长于管状花，顶端较尖，自基部到顶端依次为绿色、橘黄色、紫色。坚硬无毛，2～4列，每列15～50不等，着生于花托上。管状花(图4)多数，与托片联合。管状花纵剖可见，花冠先端5裂，裂片三角形，其上有小突起，下部联合成筒状，呈紫红色或黄白色。绿色小萼片包围着花冠。聚药雄蕊，花药联合，花粉黄色，花丝为5彼此分离。花柱细长，上部柱头二裂，弯曲成倒钩状，被有长短不一的绒毛；子房下位，内部可见一胚珠。果实为连萼瘦果，具三棱。早期种子黄白色，成熟后棕褐色或双色，子叶两枚。种子气微，破碎后味辛辣。由表2可知，甘肃、河南舌状花为紫红色，总苞片绒毛密集。其它产地舌状花为粉色，总苞片绒毛较密集。

表2 紫锥菊药材微性状差异

3.2 显微鉴别 紫锥菊粉末，黄绿色。石细胞淡黄色或无色，呈梭形、方形、类圆形，长52～126 μm，内含黄色物质或棕红色物质；导管类型为网纹导管或梯状网纹导管和具缘纹孔导管，螺纹导管多破碎，直径18～52 μm；韧皮纤维，直径11～20 μm，长梭形细胞壁厚具孔沟；木纤维短，直径6～10 μm，呈不规则梭形壁上无孔沟。两种纤维细胞内部均有密集纹孔；茎表皮细胞多角形壁多平直，外表面有平行状线型纹理，类似指纹纹理，偶见不定式气孔；髓薄壁细胞，无色，长方形且数目众多，内部纹孔成列密集散在；皮孔样突起经茎表皮纵切面偶见，表皮细胞突起形成椭圆形、圆形轮廓；非腺毛有3种，多细胞圆锥状非腺毛，由2～5细胞组成，壁厚，基部细胞宽阔，先端锐尖或稍钝，表面有疣状突起。多细胞棒状毛，细胞呈类方形，由4～6个细胞组成，壁薄，顶端钝圆，存在于叶下表皮主脉，呈匍匐状。分枝星状毛，非腺毛形如树枝状，腺毛细长，放射性排列，每个分枝状细胞顶端较尖，多存在于花萼下表面；木薄壁细胞椭圆形、长方形、壁增厚，多个细胞结合处呈连柱状，细胞壁孔沟少，胞腔大，内部纹孔密集，内含棕黄色物质；栅栏组织为1～2列长方形细胞，第一列细胞通常较第二列细胞长，排列紧密；海绵组织呈圆形或不规则形，内涵黄绿色细胞内含物，偶与导管联合；叶上表皮细胞的表面观为不规则多角形，排列较为紧密，垂周壁稍波状弯曲。叶下表皮细胞的表面观呈不规则形，垂周壁呈深波状弯曲。气孔多为不定式，副卫细胞3～5个[18]，保卫细胞为半月形，下表皮气孔数目多于上表皮；花粉粒数目较多，类圆形或椭圆形，直径22～31 μm，无色或淡黄色，萌发孔3个，表面有刺状或细颗粒状突起，刺状突起略粗；花柱头表皮细胞分化成圆锥形单细胞毛，乳头状或圆点状突起，先端尖或稍钝；花冠顶端碎片棕色或黄棕色，表皮细胞向外呈圆钝毛状或乳头状突起，常有乳头状突起散在；花粉囊内壁细胞呈长多角形或类圆形，外周壁增厚，平面观呈圆形或椭圆形，两端增厚部位呈点状；总苞上表皮细胞呈长六边形，表面角质层纹理不明显，垂周壁多平直，细胞排列紧密，细胞壁连珠状增厚，气孔少见。总苞下表皮细胞长多角形或多角形，垂周壁多弯曲，不定时气孔分布密集，气孔处角质层纹理呈放射状，副卫细胞3～5个；中果皮碎片细胞呈狭长方形或长多角形，排列紧密，壁略增厚，其上密布细小纹孔；内果皮纤维表面含棕红色色素，细胞呈类方形，排列紧密，无色素覆盖处纤维呈长条形，细胞壁增厚，有密集纹孔沟和纹孔，胞腔小；种皮表皮细胞类多角形或不规则形，壁薄，排列整齐，垂周壁平直或弯曲。粉末特征图见图5。不同产地紫锥菊粉末显微鉴别研究发现甘肃(S2、S3)、陕西(S4、S5、S7)非腺毛与叶片气孔数均多于广东产地(S13)。

3.3 理化鉴别 16批紫锥菊的薄层色谱见图6。

4 讨论

微性状鉴别研究清晰地观察到茎、叶以及管状花的内部结构，补充紫锥菊性状彩色影像信息。甘肃、陕西、广东省与其它省份药材微性状特征有所不同，推测与其地理环境、气温、湿度等有关。粉末发现表皮类皮孔样突起，且发现多细胞棒状毛多存在于叶下表面主脉上，呈匍匐状；分枝星状毛存在于花萼下表面。通过显微鉴别，可将表皮类皮孔样突起、分枝星状毛以及多细胞棒状毛作为紫锥菊的专属鉴别特征。菊苣酸可作为紫锥菊薄层色谱鉴别的指标成分。另有通过性状鉴别初步鉴定了紫锥菊与狭叶紫锥菊，但未进行微细结构上的微性状鉴别描述[19]。今后可通过微性状、显微及理化鉴别开展紫锥菊及其变种的鉴别研究。