弓形虫实验室诊断技术研究进展

张险朋，王自强，李永福，杨得胜

（1.东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086；2.福建省动物疫病预防控制中心，福建福州 350003）

弓形虫病是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种世界性分布的人兽共患原虫病，在脊椎动物中广泛传播，对胎儿和免疫缺陷患者的感染尤其令人担忧。多数学者认为弓形虫是单一种、单一血清型，但不同虫株有不同基因型[1]。根据虫株的侵袭力、繁殖速度、包囊形成与否及对宿主的致死率等，刚地弓形虫可分为强毒株和弱毒株，当前公认的代表毒株分别为强毒RH 株、弱毒Beverley 株[2-3]。弓形虫于1908 年在北非突尼斯的啮齿类梳趾鼠（Ctenodactylusgondii）体内首次被发现[4]，几乎可以感染所有温血动物。我国于1955 年首先在福建省的猫、兔等动物体内发现了弓形虫[5]，1964 年首次报告病例，但直到1977 年才引起重视。

弓形虫生长周期需要两个宿主：中间宿主广泛，多种冷血、温血动物都会被感染，终末宿主则是猫科动物[6-7]。弓形虫的生活史包括有性和无性两个生殖阶段，有性生殖只在终末宿主猫科动物的小肠上皮细胞内进行。生活史包括滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊等五种形态，前两种形态见于中间宿主和终宿主体内，后三种形态见于终宿主体内[8]。弓形虫包囊或卵囊随食物被猫科动物吃入后，便侵入小肠上皮细胞内开始增殖，其中一部分虫体从肠道中逸出，经肠系膜淋巴结向全身各器官扩散，并发育为速殖子和包囊体，完成无性生殖过程；另一部分虫体在小肠内繁殖成为大、小两种配子体，而后分别产生雌、雄配子，雌雄配子结合为合子，合子再发育为卵囊[9]。在合适条件下卵囊成熟，当中间宿主吃进成熟卵囊后，引发弓形虫病。

弓形虫病是一种机会性致病原虫病，多为隐性感染，无明显临床症状，很少发现健康宿主出现严重病症。王玉燕等[10]2017 年5—6 月对徐州市5个未免疫弓形虫疫苗的猪场母猪血清进行检测，发现经产母猪的弓形虫IgG 抗体阳性率普遍偏高，最高可达63.6%，而做过灭鼠措施或用磺胺类药物预防的养殖场母猪弓形虫IgG 抗体阳性率明显低于未做过的养殖场（P＜0.05）。Qing 等[11]用间接血凝试验（IHA）检测山东省驴群的弓形虫感染情况，结果显示弓形虫抗体阳性率为17%（213/1278）。雷雪珍[12]对2016—2018 年从广东省多地收集的宠物犬猫和流浪犬猫血样进行弓形虫荧光PCR 和ELISA 检测，发现宠物犬和宠物猫弓形虫病原学阳性率分别为0.91%和2.28%，而流浪犬和流浪猫弓形虫病原学阳性率分别为47.00%和40.00%，同时流浪犬猫的弓形虫IgG 抗体阳性率显著高于宠物犬猫。彭永喜[13]对2017—2018 年采集的沈阳地区犬、猫血清弓形虫检测发现，宠物犬、猫血清弓形虫抗体阳性率分别为27.7%、20.5%，流浪猫为43.1%。王仁通[14]对大连市旅顺口不同猪场的猪血清进行弓形虫抗体检测发现，样本总体弓形虫感染阳性率为 18.3%（87/476）。据调查[15]，人间弓形虫的隐性感染普遍存在，在机体免疫力下降或缺陷时，弓形虫可在机体内大量增殖，而后表现出一定的症状。但是动物弓形虫病很少表现出独有的特征性症状，很难通过临床症状确诊，因此该病的确诊还需要更为准确的实验室诊断技术。

1 病原学诊断

病原学诊断是最早建立的弓形虫诊断方法，操作简单，结果可靠，在20 世纪的弓形虫病诊断中起到了重要作用。

1.1 组织学诊断

组织学诊断方法是对样品染色后，通过显微镜观察，找到病原体即为确认的一种方法，常用的染色方法包括吉姆萨染色、HE 染色、过氧化物酶-抗过氧化物（PAP）染色、PAS 染色等[16-17]。采用常用的染色方法，对组织包囊进行染色，可将寄生虫与宿主细胞区分开，在镜检中发现速殖子或假包囊即可确诊为弓形虫感染，但发现包囊尚不能诊断为弓形虫感染，还应结合临床资料进行综合分析[18]。组织学诊断方法存在很多不确定性因素，虽可确认检出的虫体，但未检出时存在假阴性可能，这与未取到有虫体的部位或者弓形虫形态不够典型有关，因此该方法存在主观性以及检出率低、耗时和易漏检等缺点。随着技术的发展，不同的染色方法也开始逐步得到扩展应用。宋光明[19]采用表面修饰Protein A 的磁性纳米颗粒与弓形虫的特异性抗体孵育制备成探针，经与待检样品震荡、洗涤、重悬后在暗场显微镜下观察。由于探针与虫体表面特异性结合，暗场下衍射出可用显微镜观察的金黄色亮光的虫体轮廓，使得该方法的的最低检测限可达到104个/mL，与普通PCR 方法的检测能力相同，同时该方法检测过程只需30 min，还可直接对血液进行检测。磁性纳米颗粒因为其良好的生物相容性和低毒性而被广泛应用于生物医学领域，但在兽医诊断行业的应用还有待发展。

1.2 实验动物接种法

接种法是将待检样品制备成液体，注入动物腹腔后取其腹腔液镜检速殖子的方法。这种方法以猫生物测定法作为金标准，一般在接种后5～15 d内收集猫粪镜检卵囊。而小鼠感染后一般会引起死亡，很少产生包囊，只可以检测其腹水中的速殖子。接种法阳性检出率高，但耗时、昂贵且需要大量实验动物，不可大量应用于临床，存在一定的生物安全风险，有时还可能引起病原扩散，甚至造成操作者自身感染。

随着诊断技术的发展，病原学诊断方法由于耗时较长，无法满足快速、高效、批量的检测需求，在实验室诊断方面的应用逐步减少。

2 分子生物学诊断

2.1 常规PCR 方法

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种被广泛用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，可视为生物体外的特殊DNA 复制[20]。PCR 在反应体系中经过多个周期温度循环，一般为30～35 个循环，使特定的DNA 片段数量可增加109倍。随着PCR 技术的不断完善与发展，它已被广泛应用于分子生物学、食品学、法医学、临床医学和兽医寄生虫学等各领域。

目前，多个目标基因可用于弓形虫的PCR 检测，其中应用最为广泛的是529 bp 重复序列、B1基因以及P30基因[21]。王海燕等[22]以弓形体B1基因作为目标片段建立PCR 方法，其检出限为10个弓形虫速殖子DNA，且与寄生于猪体内的其他6 种常见微生物无交叉反应。崔平等[23]以弓形虫P30基因为目标片段建立PCR 方法，其扩增结果为预期的484 bp 片段，检出限为5 个弓形虫速殖子，且与其他2 种寄生虫无交叉反应。张云峰等[24]以弓形虫IST1基因作为目标片段建立PCR方法，其扩增结果为预期的302 bp 片段，检测限为7.81 pg/μL DNA。任科研等[25]以弓形虫微线粒体MIC3基因作为目标片段建立PCR 方法，其扩增结果为预期的1 080 bp 片段，与微小隐孢子虫、贾第虫、旋毛虫和球虫等相关寄生虫基因组无交叉反应，检出限为10 个速殖子DNA。袁恒青等[26]对安徽省猪源弓形虫的529 bp 重复序列进行了分析，发现其与GenBank 中的EF648169.1 株的同源性高达99.5%，且遗传距离最为接近，适合作为弓形虫病分子生物学诊断的目标基因。周志东[27]利用弓形虫致密颗粒蛋白GRA14基因作为检测的靶基因，建立了弓形虫的特异PCR 检测方法，检出限为2.35 个弓形虫速殖子，试验比对优于以B1基因与529 bp 重复序列为目的片段的PCR 检测方法；同时对26 个规模猪场不同类型样品的PCR 检测结果显示，血液、废料、尿液、组织、精液、废水中均可检出弓形虫阳性，而血液样品更适用于猪场弓形虫病的临床诊断和监测。

巢式PCR 是利用2 套引物对目标基因开展2轮扩增的方法，可在微量的DNA 模板中获得高浓度和高纯度的靶基因片段。但巢式PCR 技术缺点亦相对明显，因需两次扩增，使操作过程较为繁琐，且对实验室基础有较高要求，较容易出现假阳性[28]。张莹光等[29]利用529 bp 重复序列建立的巢式PCR检测方法能特异性扩增出弓形虫基因片段，检测限为0.1 pg 的弓形虫基因组DNA，敏感性是普通PCR 的100 倍。

2.2 环介导等温扩增法（LAMP）

LAMP 是核酸扩增技术中的一种，被广泛应用于各种领域，包括疫病诊断和生物学鉴定。该方法利用了BstDNA 聚合酶的置换活性，在等温条件下，通过4 对引物识别目标基因的6 个区域[30]，敏感性高、特异性好，可以检测病毒、细菌和真菌等病原体，也被广泛应用于寄生虫病诊断。Sotiriadou 等[31]依据弓形虫的目标基因建立了检测水样中弓形虫的LAMP 方法，检出限为0.1 个弓形虫滋养体DNA。Zhang 等[32]根据弓形虫Rep529基因的保守区域建立弓形虫LAMP 方法，检出限为0.1 pg/mL，对疑似组织样本的阳性检出率为85.7%，比普通PCR（76.9%）高，证明LAMP 方法比PCR 方法更灵敏。随后，有LAMP 应用于小鼠各种组织器官和患者血液样本的弓形虫感染检测[33-34]。郭俊杰等[35]以弓形虫529 bp 重复序列为目的片段建立的LAMP 技术可以检测到弓形虫微量DNA。宇芙蓉[36]根据弓形虫WH6 株表面抗原1 的基因序列分别建立了LAMP 和PCR 检测方法，发现LAMP 的敏感性为PCR 的100 倍；对已知背景的样品进行检测，发现LAMP 符合率为100%，而PCR 只有74%，两种检测方法结果相比具有统计学差异（P＜0.05）。Mirahmadi 等[37]用LAMP方法检测了118 名精神分裂症患者的血样，发现弓形虫检出率为47.4%，比之前用巢式PCR检测的（检出率34.7%）要高。Sun[38]针对弓形虫的529 bp 保守序列建立的LAMP 方法，检测限达到单个速殖子或10 个重组质粒，检出率为7.0%，比常规PCR方法（2.5%）高。LAMP可以在没有精密仪器时快速、简便开展检测，其扩增产物可以通过荧光定量、电泳检测，沉淀可以通过离心后肉眼观察，不需要特殊的设备辅助，但由于该方法的高灵敏特点，受污染影响较大，因此在试验过程中要严格做好质量控制，防止假阳性发生。

随着各项技术的发展，不同检测技术间的联用也成为可能。薛杨继[39]将LAMP 方法与测流试纸条（LFD）联用，建立了LAMP-LFD 方法，检测弓形虫的529 bp 重复序列。通过LFD 试纸条读取LAMP 反应结果，可在1 h 内最低检出1 fg 弓形虫全基因组。该方法灵敏度是PCR方法的100倍，同时实现了将分子检测结果转化成可视化的免疫检测，直接通过试纸条读取，简化了LAMP 产物的鉴定过程。

2.3 荧光PCR 方法

目前，荧光PCR 技术是最常见的核酸检测方法，其在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，被广泛应用于核酸检测。2000 年，Lin 等[40]根据弓形虫的B1基因首先建立了弓形虫荧光PCR 方法，检出限为0.05 个弓形虫速殖子。该方法用于胎儿组织切片时的检测阳性率与巢式PCR 一致，均为33.3%。Santoro 等[41]应用建立的荧光PCR 方法，对117头野猪组织样品进行弓形虫检测，发现78 头野猪弓形虫阳性，阳性率为44%。Lass 等[42]根据弓形虫B1基因建立荧光PCR 方法，对食用蔬菜的弓形虫污染情况进行检测，发现阳性率为3.6%，这是首次对新鲜蔬菜进行弓形虫调查。雷雪珍[12]以弓形虫的529 bp 重复序列作为靶标建立了弓形虫荧光PCR 方法，该方法稳定性好，R2在0.999 以上，检出限为10 拷贝/μL，灵敏度是普通PCR 的100 倍以上。袁淑萍[43]等根据弓形虫保守基因序列建立的猪弓形虫实时荧光定量 PCR 检测方法，在 101～107拷贝/μL 模板范围内有很好的线性关系，检出限可达101拷贝/μL。Khadijeh 等[44]用荧光PCR 方法和巢式PCR 方法对视网膜脉络膜炎患者的弓形虫B1基因进行检测，结果显示荧光PCR方法对B1基因的检出率达90%，而巢式PCR 方法仅能检出10%的病患，显示荧光PCR 方法的敏感度高于巢式PCR 方法。同时也发现，外周血单核细胞比全血或血清更适合用于弓形虫检测。荧光PCR 方法在试验过程不用开盖，引物和探针相结合使用，特异性、敏感性较高，且不容易被污染，是目前应用最广泛的核酸检测技术。

2.4 数字PCR 方法

数字PCR 方法（digital PCR，dPCR）是在荧光PCR 基础上发展而来的一种核酸绝对定量检测方法，于1999 年首次由Bert Vogelstein 和Kenneth W.Kinzler 提出。该方法利用指数型函数和线性函数之间的转化，对模板进行有限稀释，根据荧光信号进行精确定量，被称为第三代PCR 技术。Marino 等[45]用建立的数字PCR 方法检测西西里岛鱼样品中的弓形虫，在来自12 种鱼类的147 份样本中，32 份被发现感染弓形虫DNA；在16 份鱼肉、表皮样本和11 份肠道、鳃样本中检测出弓形虫DNA，定量检测的结果为5.7×104copies/mL。证实了鱼类虽然不是弓形虫的生物宿主，但是有可能受到弓形虫卵囊的污染。其原因可能是未经处理的污水排放至江河，卵囊经河流流入海洋，而鱼类充当了机械载体。数字PCR 方法可以做到样品DNA 绝对定量，在低浓度样品的检测中更有优势，并且扩增反应受酶抑制剂的影响更小。

分子生物学诊断方法虽然灵敏，但其检测的主要对象是弓形虫核酸，检测结果受多个因素影响。张烨华等[46]选取了市售的6 种DNA 检测试剂盒对含弓形虫速殖子的猪膈肌样品分别进行基因组DNA 提取，结果显示不同方法提取的DNA用PCR 检测的结果存在一定差异，以TIANamp Genomic DNA Kit 提取效果最好。研究也发现不同荧光PCR 的温度升高和降低，对弱阳性样本的检出率有很大影响，如伯乐CFX96（荧光定量PCR 仪）在反应程序整体温度调高2 ℃或调低1 ℃范围内，有利于弱阳性样本的检出。因此，应用分子生物学方法对弓形虫病原体进行检测，需要针对不同的检测对象不断优化试验条件，以确定最佳检测方案。

3 免疫学诊断

3.1 染色试验（DT）

染色试验方法于20 世纪40 年代被首次提出，根据特异性抗体与虫体辅助因子发生协同作用后虫体胞浆对碱性美蓝的亲和力差异所设计，具有良好的敏感性和特异性。活滋养体与样本中的抗体相作用，可加速滋养体发生变性，裂解虫体表膜使虫体表膜不被美蓝所染，镜检观测待检样品，50%不被着色者判为阳性[47]。但该检测需要活的滋养体，在样品保存、制备过程存在生物安全风险，因此使用受到很大限制。

3.2 间接血细胞凝集试验（IHA）

该检测方法以抗原抗体特异性结合和弓形虫可溶性抗原致敏于红细胞表面，出现肉眼可见的凝集现象的特性而建立，具有便捷、快速、经济等优点，适合弓形虫病的大规模筛选。全敏秀[48]用IHA 对湖南省 14 市（州）未进行弓形虫疫苗免疫的鸡群开展弓形虫感染情况调查，发现湖南省弓形虫总抗体阳性率为33.6%（457/1 360）。张克传[49]对感染家兔用IHA 与其他检测方法进行比较，结果显示IHA 的检测特异性为93.3%，敏感性为47.6%，总符合率为86.6%。向忠菊等[50]在弓形虫血清学调查中应用IHA方法来检测猪弓形虫的感染情况，结果显示IHA 方法的缺点是会与血清发生交叉反应，重复性较差，致敏红细胞不稳定，易发生非特异凝集而使试剂难以标准化。

3.3 改良凝集试验（MAT）

MAT 作为国际上公认的弓形虫检测“金标准”，具有准确率高、特异性好等优点。该方法于1997 年由Desmonts 首次建立[51]。Dubey 等[52]利用1 000 头弓形虫感染母猪的血清进行多种抗体检测方法对比试验，比对结果显示MAT 在猪的弓形虫隐性感染和发病检测中均可行。佐思[53]用改良的MAT 试剂盒对91 份人血清、290 份猪血清、63 份小鼠血清进行检测，并与ELISA 和进口MAT试剂盒进行比对，结果表明改良的MAT 试剂盒具有良好的特异性和敏感性，检出率高于ELISA 试剂盒，准确率与进口的MAT 试剂盒相同，重复性好。杨娜等[54]应用MAT 与IHA 分别检测了辽宁省不同地区不同动物的3 789 份血清，结果显示MAT 法判定标准，敏感性、特异性和准确性都优于IHA。王仁通[55]用IHA 和MAT 对猪血清进行检测，同时辅助进行PCR 判定，发现MAT 检测结果与PCR 一致，而IHA 存在漏检和假阳性情况。Fernandes 等[56]用IHA 和MAT 同时检测了89 只家猫，发现IHA 的阳性检出率为18%，MAT 为26%；IHA 的相对特异性达到了100%，但相对敏感性仅为70%。

3.4 间接荧光抗体试验（IFAT）

IFAT 方法已在国外得到广泛应用，是一种理想的弓形虫抗体血清学检测方法，现已开发出商业化试剂盒，但由于国内市场需求较小，间接荧光抗体试剂商业化程度明显不足。孙希萌等[57]2008—2012 年对吉林和河北地区医院和精神病院人群进行弓形虫抗体检测，发现IFAT 方法检出的弓形虫抗体阳性率为3.97%，与ELISA 的总体符合率仅为51.2%，因而在缺少标准参照的情况下，国产技术的稳定性还有待考量。卢致民等[58]研制的弓形虫IFA 试剂盒与德国Viro-Immun 的试剂盒Youden指数分别为0.91 和0.98，敏感性和特异性间差异无统计学意义（P＞0.05），且自制试剂盒在4 ℃条件下保存期为6 个月。目前国内关于IFAT 的报道很少，但该方法在制片染色后即可通过显微镜观察结果，同时操作较为方便而具有良好的开发推广前景。

3.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）

弓形虫的ELISA 检测方法在所有弓形虫检测技术中应用最普遍。罗才庆等[59]分别采用 IHA 和ELISA 方法检测弓形虫抗体并做对照试验，研究发现IHA 和ELISA 方法均可用于猪弓形虫病的血清学调查和诊断，而且两种方法的差异并不显著，符合率也较高。张静[60]利用弓形虫单克隆抗体B6G 建立了弓形虫阻断ELISA 检测方法并对32 份猪血清进行检测，发现阳性率与MAT 法一致，阳性符合率为87.5%，阴性符合率为100%，表明所建立的阻断ELISA 方法能有效检出临床猪血清的弓形虫抗体。李祎等[61]建立的循环抗原双抗体夹心ELISA 方法，最低能够检测到血清中1.5 ng/mL GRA1 抗原。该方法与nPCR 相比具有较高的一致性，较市售商品化试剂盒更为准确可靠。Liyanage等[62]系统比较了现有的ELISA 分析方法，包括检测试剂组分、检测性能，涵盖了4 个数据库发表的57 篇文献。在所调查的研究中，间接ELISA（占比95%）和自制ELISA（占比67%）是研究过程中最常见的检测方法，在市售的试剂盒中法国IDvet 公司的“ID Screen®”多物种间接ELISA 试剂盒较为常见，因该试剂盒采用P30（SAG1）抗原和抗多组分偶联物作为二抗，使其适用于反刍动物、猪、犬和猫等多物种的血清弓形虫特异性抗体检测，也可用于牛奶或肉汁的检测。

虽然国内诊断试剂盒的质量与进口试剂盒有一定差距，但也可满足猪场日常检测工作需求。黄翠琴等[63]对80 份猪血清样品进行检测，比较了三种国产弓形虫抗体检测试剂盒的质量差异，结果显示国产的弓形虫IgG 抗体检测试剂盒性能稳定，通过一致性检验三种试剂盒的Kappa 系数分别为0.57、0.75、0.64，检测结果一致性表现为中高度，差异不显著（P＞0.05），可用于猪场的日常检测工作。

3.6 胶体金快速诊断技术

20 世纪80 年代末期，人们将胶体金标记技术、免疫检测技术与层析分析技术结合发展建立了胶体金免疫诊断技术，由于其便捷、无污染、结果直观等优点而得到了广泛应用。卢爱桃等[64]采用ELISA 和胶体金免疫层析法（GICA）对呼和浩特市254 只犬猫进行弓形虫抗体检测，发现两种方法无明显差异。ELISA 方法虽更为灵敏，但实际操作时需要专业的仪器设备；GICA 方法则操作简单，不需要实验设备，易于推广。张宁[65]以GRA6-GRA2 蛋白作为标记抗原制备了弓形虫抗体检测试纸条，对临床289 份血清样本进行检测，将结果再与间接血凝试剂盒进行比对，发现试纸条的阳性检出率为2.42%，而间接血凝试剂盒为2.07%，二者符合率为99.5%。张宁[66]用GRA6-GRA2 蛋白作为标记抗原制备胶体金试纸用于检测猫弓形虫抗体，发现胶体金试纸敏感性为1:256，用胶体金试纸与间接血凝试剂盒对289 份样本血清进行检测，发现二者符合率为99.5%。卓国荣[67]对280 份犬血清进行检测，用间接血凝检测和胶体金试纸检出的阳性数分别为23 份（阳性率8.21%）、25 份（阳性率8.93%），结果表明两种方法差异不显著。但胶体金试纸操作简便、快捷、灵活，适合于快速检测。

4 展望

作为一种人兽共感染寄生虫，弓形虫不仅影响畜牧业，造成巨大经济损失，还对公共卫生和动物源性食品安全构成严重威胁。由于该病的临床特征不是很明显，所以弓形虫病诊断需要通过实验室检测才能确诊。目前，免疫学检测方法以ELISA和IHA 方法为主，已有较为成熟的商品化试剂盒或诊断试剂，这些方法在大规模检测和流行病学调查中起到了很大的作用，为弓形虫病防控提供了更为广泛的技术支持。分子生物学方法近年来得到了长足发展，与传统的病原学检测方法相比，其速度、通量、特异性、敏感性各方面都有提升，相较于免疫学诊断，避免了获得性免疫带来的假阳性结果。虽然分子生物学诊断技术在部分领域仍有一定局限性，但高度的特异性、敏感性优点仍使其应用前景广泛，其对弓形虫病的流行病学调查、检验检疫和临床诊断十分重要，是未来弓形虫病实验室诊断的主要发展趋势。