NF-κB相关信号通路在肾缺血-再灌注损伤中作用的研究进展

张瑞波 申开文 袁强 王强 沈俊

缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是肾移植中复杂且不可避免的病理生理过程，同时也是移植肾出现无功能或功能延迟的最重要原因之一。IRI的机制较为复杂，迄今为止，有关IRI的发生机制和病理生理过程的研究尚无定论。据报道，肾IRI中的炎症反应可能与T细胞介导和抗体介导的急性排斥反应有关。此外，肾IRI也可能会导致肾间质纤维化和肾小管萎缩，从而引起慢性移植肾功能障碍[1]。肾IRI常伴随着促炎因子的释放，使肾小管结构受损，并导致肾小管细胞的损伤和死亡，是急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的常见因素[2]。核因子（nuclear factor，NF）-κB作为许多炎症反应信号通路的关键因子，对肾IRI炎症反应的调控起着十分重要的作用。本文将从NF-κB相关信号通路入手，对肾IRI的可能机制进行总结，以期为肾IRI的防治提供参考。

1 NF-κB信号通路的作用机制

1.1 NF-κB的结构组成

NF-κB是一个转录因子家族，由5个家族成员组 成， 即 p65/RelA、RelB、c-Rel、NF-κB1（p50/p105）以及 NF-κB2（p52/p100）。5个成员都具有一个结构保守的氨基末端Rel同源结构域（Relhomology domain，RHD）包括二聚体、核定位和DNA结合结构域。p65/RelA、RelB、c-Rel不仅具有表达阳性调控所必需的转录激活域（transcription activation domain，TAD），还具有促进基因转录的反式激活域，该反式激活域被激活后，NF-κB亚单位形成同源或异源二聚体。而p50和p52由于缺乏TAD，可能抑制转录，p50和p52同源二聚体可与NF-κB反应启动子上的κB位点结合，起到检查NF-κB反式激活的作用。NF-κB信号通路由受体和受体近端信号接合器分子、IκB激酶（IκB kinase，IKK）复合物、IκB蛋白及NF-κB二聚体组成，可分为依赖NF-κB必需调节器（NF-κB essential modulator，NEMO）的经典激活途径和不依赖NEMO的非经典激活途径[3-4]。

1.2 NF-κB信号通路的激活途径

1.2.1 依赖NEMO的经典激活途径NF-κB经典激活途径形成的二聚体主要是RelA/p50和RelA/p52，可由各种细胞因子、氧化应激以及T细胞受体（T cell receptor，TCR）等诱导刺激。在经典激活途径中，刺激物包括肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族、白细胞介素（interleukin，IL）-1受体、Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）超家族、TCR或细胞内介质的膜结合受体。在刺激物作用下，核糖体失活蛋白（ribosome inactivating protein，RIP）-1作为RIP家族最重要的成员，是NF-κB信号通路中真正的适配器。在TNFR1相关的信号传导中，RIP-1通过招募IKK综合体，组成由支架蛋白NEMO（IKKγ）和两个IKK亚基（包含IKKα和IKKβ两种激酶）构成的IKK复合物。该信号复合物组装成核后，通过NEMO的低聚物化和IKK自磷酸化，诱导IKK活化。IKK活化后可激活IκB激酶，使IκB降解和磷酸化，促进NF-κB p65/p50二聚体释放，使p65亚单位升高，并隐藏NF-κB核定位信号，NF-κB转录因子转录至细胞核，从而激活NF-κB信号通路[3,5]。

1.2.2 不依赖NEMO的非经典激活途径非经典激活途径中，在CD40等因素的刺激下，TNFR相关因子（TNFR-associated factor，TRAF）家族成员中的TRAF3和 TRAF2/6与 NF-κB诱 导 激 酶（NF-κB inducing kinase，NIK）相互作用，诱导NIK的泛素化和降解，并与两个IKKα亚基组成的复合物发生反应，使p100降解加工为具有活性的p52，p52与RelB反应组成异源二聚体转移到细胞核内，激活NF-κB非经典信号通路[3]。

2 NF-κB炎症相关信号通路在肾IRI中的调控作用

2.1 NF-κB上游信号通路对肾IRI的调控机制

2.1.1 多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1对NF-κB的调控机制多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly adenosinediphosphate-ribose polymerase，PARP）-1是PARP家族中研究较多的典型成员，可参与炎症反应、免疫反应和DNA修复等过程[6]。在肾IRI中，PARP-1作为调控炎症反应的转录辅助激活剂和辅助加压因子，其活化过程为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导损伤时，PARP-1保守位点Y829发生磷酸化，导致PARP-1激活和表达增加，此过程是PARP-1催化活性和NF-κB依赖的促炎调节必经之路。Y829的磷酸化导致PARP-1的激活和表达增加，其激活可能通过参与调节NEMO单元泛素化，调节p65亚基磷酸化（Ser536）和乙酰化（Lys310），触发IKK对IκBα的活化，促进LPS诱导的NF-κB p65核转移及表达，激活NF-κB通路，促进炎症反应的发生及对肾小管产生破坏性损伤，导致细胞死亡或功能障碍，进而导致肾IRI[7-10]。由此可见，通过对PARP-1的调控，可以影响NF-κB的活性。既往研究表明，使用PARP-1抑制剂JPI-289可以减弱NF-κB的表达，发挥抗炎作用，减轻炎症反应，从而减轻肾IRI[10]。其中代表性的药物瑞芬太尼、苦味苷Ⅱ等可通过下调PARP-1表达水平，抑制NF-κB通路的激活，减轻肾IRI[8,11]。但目前靶向PARP-1减轻肾IRI的药物研究仍较少，未来可进一步探究PARP-1的靶向药物，为临床肾IRI的防治提供新的方向。

2.1.2 Toll样受体4对NF-κB的调控机制TLR是跨膜蛋白家族，当发生肾IRI时，作为IRI过程中重要的炎症级联反应，TLR4信号通路被激活和高水平表达。TLR4信号通路的主要激活过程为LPS与LPS结合蛋白的相互作用，促进TLR4与CD14受体结合，导致TLR4二聚体修饰物向细胞膜寡集形成受体复合物，随后TLR4与衔接蛋白——髓样分化 因 子 88（myeloid differentiation factor，MyD88）作用，MyD88 N末端的Toll-IL-1受体结构域（Toll-IL-1 receptor domain，TIR） 通 过 TIR/TIR相 互 作用，介导其与TLR结合，而MyD88 C末端的死亡结构域又可与IL-1受体相关激酶（IL-1 receptorassociated kinase，IRAK）-1和IRAK-4的死亡结构域结合，使IRAK-1/4被招募到TLR复合物。紧接着，下游分子TRAF-6被招募到TLR复合物并被IRAK-1或IRAK-4激活。通过转化生长因子-β活化激酶1结合蛋白（transforming growth factor-βactivated kinase 1 binding protein，TAB）1/2/3的作用，TRAF-6从受体复合物中分离并与转化生长因子-β活 化 激 酶（transforming growth factor-β-activated kinase，TAK）1结合。在IRAK-1被降解后，TRAF-6-TAB1/2/3-TAK1复合物进入细胞质，诱导TRAF-6介导的TAK1活化，激活IKK，使NF-κB从IκB中被释放，NF-κB从细胞质转移到细胞核并介导细胞因子的过度表达，增强炎症相关蛋白NF-κB的信号级联，最终导致肾IRI的发生[12-14]。

NF-κB是TLR的关键下游因子。研究表明，糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）、髓样分化蛋白（myeloid differential protein，MD）-2、白头翁皂苷B4等物质可通过上调肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-1β、IL-6 的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达水平，促进炎症因子释放，激活TLR4/NF-κB相关通路，导致氧化反应和下游炎症因子产生的损伤，从而加重肾IRI[12-14]。而白藜芦醇、紫檀芪、左归饮、灵芝酸等物质则通过降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3 活性和Caspase级联反应，抑制TLR4的表达，并促进IκB表达，减少磷酸化NF-κB和磷酸化IκB的表达，降低氧化应激和细胞凋亡水平，减轻炎症反应，延缓肾IRI[15-18]。此外，TLR4作为NF-κB的上游信号通路，被证实参与细胞焦亡经典激活途径的调控，未来可针对肾IRI中细胞焦亡的经典激活途径进行更深入的研究，为临床上肾IRI的防治提供新的启示。

2.1.3 Wnt/β-catenin对NF-κB的调控机制Wnt/β-catenin信号通路是研究最多的经典Wnt通路，β-catenin是细胞间连结的典型Wnt信号通路的重要组成部分。在正常人肾脏中，Wnt通路处于相对沉默状态，当发生肾IRI时，肾巨噬细胞分泌Wnt蛋白，Wnt信号被激活，在经典信号通路中与低密度脂蛋白受体相关蛋白（low-density lipoprotein receptorrelated protein，LRP）5、LRP6以及细胞表面受体卷曲蛋白（frizzled，Frz）结合，磷酸化激活胞内散乱蛋白（dishevelled，Dsh）与Frz胞内区的结合产物，抑制GSK-3β的活性，使GSK-3β脱离出蛋白复合体，导致蛋白复合体不能降解β-catenin，使得β-catenin不能被磷酸化，从而在胞质内大量蓄积并转移到细胞核，与转录因子中的T细胞因子/淋巴增强因子（T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF） 结 合后，在辅助因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/p300（cyclic adenosine monophosphate response element-blinding protein-binding protein/p300，CBP/p300）的帮助下，通过转录上调编码区决定子结合蛋白（coding region determinant-binding protein，CRD-BP），保证其介导的含β-转导重复序列的蛋白质（β-transducing repeat-containing protein，βTrCP）mRNA稳 定 化，从而促进βTrCP介导的IκB降解，促进NF-κB的核转移，激活NF-κB信号通路，加重肾脏炎症反应，促进下游炎症因子转录，抑制抗氧化因子，从而诱导肾IRI的氧化应激和炎症反应[19-22]。其次，β-catenin蛋白的蓄积还可通过诱导p38活性，介导NF-κB的激活，但具体调控机制尚不明确。此外，有研究表明β-catenin蛋白可通过上调TNFR超家族成员19（TNFR superfamily member 19，TNFRSF19）mRNA表达水平，活化IKK复合物，激活NF-κB，表明Wnt/β-catenin信号通路在促炎功能上存在着另外一条潜在道路，但该道路的具体机制在肾IRI中尚未明确，未来仍需进行相关研究进一步阐明[22]。有研究表明，联用维生素D和吡格列酮可对Wnt/β-catenin通路、NF-κB等进行调节，有希望对肾脏起保护作用[23]。目前靶向于Wnt/β-catenin对NF-κB进行调控的药物研究尚少，针对相关靶向药物进行研发，可为肾IRI的防治提供新的思路。

2.1.4 磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B对NF-κB的调控机制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路高度保守，其激活受到严格的控制。在肾IRI引起的炎症反应中，PI3K/Akt信号通路激活的机制主要是PI3K通过改变Akt蛋白结构使其活化，使NF-κB磷酸化被抑制，转录活性减弱，抑制TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子表达，从而减轻肾IRI导致的炎症反应[24-25]。Zhang等[24]的实验发现，在进行大鼠肾IRI造模前30 min腹腔注射促红细胞生成素（erythropoietin，EPO），可以增强EPO受体活性，并通过进一步激活PI3K/Akt信号通路，抑制NF-κB磷酸化，显著减轻肾功能不全，抑制炎症反应，但抑制PI3K/Akt信号通路对肾IRI引起的炎症反应的影响尚未阐明。Hu等[25]的研究报道指出，使用苦豆碱预处理的C57BL/6小鼠，可以通过PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，抑制NF-κB转录活性，减轻肾IRI引起的炎症损伤，保护肾小管细胞免受凋亡。此外，蛇床子素、四甲基哌啶、尼可地尔等也被证实通过激活PI3K/Akt信号，降低NF-κB p65及磷酸化-p65的表达，缓解肾缺血-再灌注引起的AKI[26-28]。由此可见，PI3K/Akt在肾IRI中起关键作用，但PI3K/Akt对肾IRI的调控机制不只局限于NF-κB信号通路。对此，未来应尽可能对PI3K/Akt在肾IRI中的调控机制进一步阐明。

2.2 NF-κB下游信号通路对肾IRI的调控机制

2.2.1 NF-κB对NOD样受体蛋白3炎症小体的调控机制NF-κB对下游通路的影响主要是通过细胞焦亡途径。细胞焦亡是一种炎症相关的细胞程序性死亡，表现为细胞快速且持续性增大至细胞膜破裂，常伴随着NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的增多及大量促炎因子的释放，进而引起炎症反应，导致细胞损伤。细胞焦亡是以炎症小体形成为标志，依赖Caspase-1激活，是一种细胞内和细胞外刺激的适应性免疫。NLRP3作为炎症小体中研究最多的蛋白，其促进炎症反应的激活方式可以通过依赖Caspase-1的经典激活途径和依赖Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11的非经典激活途径[29]。NF-κB主要作用于依赖Caspase-1的经典激活途径。在经典激活途径中，NLRP3在上游信号分子诸如三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、细菌毒素、病毒等刺激下，通过激活TLR/IL-1受体，促进下游NF-κB活化，NLRP3在泛素化后，其N端效应结构域与凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing a CARD，ASC）和Caspase-1前体（pro-Caspase-1）结合，形成多蛋白复合物，活化的Caspase-1切割促炎因子IL-1β前体（pro-IL-1β）和IL-18前体（pro-IL-18），引起IL-1β和IL-18释放，促进炎症反应，同时促进Gasdermin D（GSDMD）蛋白剪切为GSDMD-N，导致细胞膜形成小孔，水分内流，细胞肿胀至细胞膜破裂，引起炎症相关反应，介导细胞焦亡，导致肾IRI[29-31]。

近期有研究指出，转录诱导精子形成基因40（transcription-induced spermatogenesis gene 40，Tisp40）、顺铂及叶酸等可通过促进NF-κB磷酸化，促进NLRP3炎症小体激活，增强肾小管上皮细胞GSDMD介导的细胞焦亡，导致肾IRI[30,32-33]。NF-κB抑制剂小白菊内酯、羟氯喹、蛋白激酶R抑制剂C16、维生素D受体、异丁司特、左归饮等可以下调NF-κB信号，降低核内NF-κB p65水平，抑制NLRP3信号通路，下调Caspase-1、GSDMD的表达，从而减轻肾IRI[17,30,32-35]。NLRP3作为NF-κB下游因子，与肾IRI密切相关[36-38]，但有关NLRP3炎症小体对肾IRI的调控机制尚未完全阐明，且尚无针对NLRP3炎症小体的靶向药物。未来应针对肾IRI中NLRP3炎症小体的调控机制进行深入研究，研发特异性药物，为临床上行肾移植及肾部分切除术的患者提供有力的帮助。

2.2.2 NF-κB对缺氧诱导因子-1α的调控机制缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α是对缺氧的适应性反应的主要调节因子，在肾缺血-再灌注、单侧输尿管梗阻和败血症诱导的AKI模型中，HIF-1α在肾小管上表达的转录水平显著增加。HIF-1α的最佳积累依赖于IKKβ，在缺氧条件下，巨噬细胞中的IKK会被激活，诱导IKKα/β和IκBα的磷酸化，促进IκBα降解，NF-κB被激活后，NF-κB p50/p65复合物通过直接与HIF-1α启动子结合并增强其转录，产生的HIF-1α可以防止AKI中的肾小管损伤[39-40]。据文献报道，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）MALAT1在缺氧条件下，通过与细胞核中的NF-κB相互作用，抑制其DNA活性，同时抑制NF-κB p50/p65复合物与HIF-1α结合，从而减轻肾脏炎症反应[41]。Yu等[42]研究发现，缺氧应激后NF-κB信号通路激活，NF-κB p50的DNA结合活性增加，HIF-1α表达增多，同时在HIF-1α依赖的lncRNA中，应激诱导的银屑病易感性相关RNA基因（psoriasis susceptibility-related RNA gene induced by stress，PRINS）与调节激活正常T细胞表达和分泌的细胞因子（regulated on activation,normal T-cell expressed and secreted，RANTES） 表达增加，通过形成缺血后炎症反应介导AKI，即通过 HIF-1α-lncRNA-PRINS-RANTES轴在 AKI中发挥调节作用。Han等[43]发现，采用膜G蛋白偶联胆汁酸受体 -1（G protein-coupled bile acid receptor-1，GPCBAR1，TGR5）激动剂胆石酸治疗大鼠，可上调水通道蛋白2（aquaporin 2，AQP2）和HIF-1α的表达，同时降低NF-κB p65和IL-1β的表达水平。虽然有关HIF-1α的研究较为热门，但在肾IRI中，HIF-1α对NF-κB的调控机制尚无定论，且暂无针对人体中HIF-1α预处理的药物和技术，有待对其进行深入研究，从而临床肾IRI防治提供新的思路。

3 小结与展望

NF-κB家族作为炎症反应的核心，通过与PARP-1、TLR4、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等 上 游 因子及NLRP3、HIF-1α等下游因子共同作用，在肾IRI中发挥十分重要的作用。但目前在肾IRI的防治中，有关NF-κB上、下游通路之间的作用机制尚未完全阐明，针对NF-κB上、下游信号通路调控的靶向药物仍较少，如果未来能对此进行深入研究，将会为临床上治疗肾IRI提供新的方案和方向，也将为肾IRI的防治带来更多的思考和启示。