基于网络药理学及分子对接探讨透脓散以IL－6为核心的免疫炎症调控干预肉芽肿性乳腺炎的机制及验证研究

刘春妘，刘晓菲，，3✉，孙颖，陈翰翰，张丽美

（1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014；3.山东省中医经典名方协同创新中心，山东 济南 250014；4.山东省中医药研究院，山东 济南 250014）

肉芽肿性乳腺炎（granulomatous mastitis，GLM）是特发性乳腺肉芽肿性炎症的统称，是一种罕见的不明原因导致的非干酪性肉芽肿和小脓肿局部化到乳腺小叶的疾病［1］。本病病因尚不明确，现代研究发现本病的发病与炎症反应、泌乳素增高及自身免疫等原因相关［2－4］。

近代医家认为本病的治疗全程贯穿消、托、补三法，尤以托法为枢机，在急性期“清托”使痈疡内消，迁延期可结合“补托”对伴发的痰、浊、瘀、毒起到消散作用，以加减透脓散配合其他药物治疗，临床收效良好［5－6］。西医关于GLM 的治疗尚无统一标准，一般采用观察、类固醇、手术干预或免疫抑制剂疗法（例如甲氨蝶呤），手术切除不仅影响乳房外观且复发概率高，患者大多难以接受［7］。因此保守治疗显得尤为重要，透脓散加减治疗GLM 临床疗效较好，临床治愈率较高。

因此，本研究借助网络药理学，研究透脓散治疗GLM 的潜在作用机制，并利用临床试验验证透脓散干预的以IL－6 为核心的免疫炎症调控机制，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 主要仪器及试剂

RM2235 切片机（德国LEICA 公司）；捷达光学显微镜550D（沈阳优软科技发展有限公司）；EG1150H型生物组织包埋机（德国LEICA公司）。

兔抗人IL－6 多克隆抗体（WL02841）、生物素标记山羊抗兔IgG（WLA037）、SP 免疫组化试剂盒（WLA044）、DAB 显色试剂盒（WLA022）、PBS 缓冲液（WLA102）、柠檬酸钠抗原修复液（WLA061）均为沈阳万类生物科技有限公司产品。

1.2 透脓散制备

组方：黄芪30 g，当归15 g，皂角刺9 g，川芎12 g和醋穿山甲3 g。全部中药由山东中医药大学附属医院中药房提供并进行统一煎制，每剂煎煮至400 mL，早晚两次分服。

2 网络药理学

2.1 方法

2.1.1 筛选透脓散的活性化合物

采用中药系统药理学数据库分析平台（Traditional Chinese Medi－cine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分别检索“黄芪”“川芎”“当归”“皂角刺”，因穿山甲为国家保护动物，且2020 版《中华人民共和国药典》已将穿山甲移除，本着对稀有动物保护的原则，本研究未对穿山甲进行检索及分析。根据口服利用度（OB）≥ 30%、药类性（DL）≥ 0.18 的ADME 属性值对中药有效成分进行初筛，获得其活性化合物［8］。

2.1.2 “药物－化合物－靶点”网络构建

查找活性化合物成分的靶点蛋白，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及黄芪多糖应用Swiss Target Prediction 数据库查找其靶点信息，运用Cytoscape 分析并构建“药物－化合物－靶点”图。

2.1.3 疾病靶点筛选及药物疾病相互作用分析

在GeneCards、OMIM、TTD 疾病靶点数据库［9］以“granulomatous lobular mastitis”为关键词检索疾病基因，药物靶点和疾病靶点相互映射。将上述得到的潜在靶点从STRING 数据库［10］界定“Homo Sapiens”得到蛋白相互作用关系，保存TSV 文件导入Cytoscape 运用BisoGenet插件进行拓扑分析。

2.1.4 绘制作用机制图并分析其作用机制

将上述筛选得到的靶点信息导入DAVID 数据库［11］，界定P＜ 0.05，进行GO 及KEGG 富集分析，将富集分析结果进行整合分析，选取富集排名前20 名的条目，通过OmicShare 云平台绘制GO－BP、KEGG 气泡图，并应用Cytoscape绘制通路靶点图。

2.2 结果

2.2.1 透脓散活性化合物成分

通过TCMSP 分别检索“黄芪”“川芎”“当归”“皂角刺”后得到活性化合物，虽然黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的OB、DL 值较低，黄芪多糖未收录入TCMSP，但这些成分均已被证实是黄芪的主要活性成分，因此也一同纳入。透脓散中化合物共得到969 个，主要包括异黄酮、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、β－谷甾醇、槲皮素等。部分活性化合物见表1。

表1 透脓散部分活性化合物的基本信息

2.2.2 “药物－化合物－靶点”网络

运用Cytoscape 软件构建“药物－活性化合物－靶点”图，见图1。该网络共有261个相互作用靶点，网络中绿色三角形代表透脓散中的药物（CX 代表川芎，DG代表当归，ZJC 代表皂角刺，HQ 代表黄芪），浅蓝色圆形代表活性化合物，橙色菱形代表靶点基因。一个化合物可与多个靶点相联系，与中药多成分、多靶点的特点契合，靶点也并非单独发挥作用，而是相互联系、相互协作的关系。

图1 “药物－化合物－靶点”网络图

2.2.3 透脓散治疗GLM的潜在作用靶点及拓扑分析

通过GeneCards、OMIM、TTD数据库共检索到79个GLM 的潜在靶点，与药物靶点进行相互映射制作韦恩图，共得到18个交集靶点，见图2。将这18个靶点导入Cytoscape 运用BisoGenet 插件进行拓扑分析，得到PPI蛋白互作网络图，见图3。根据Degree值筛选排名前10名的重要靶点，详细信息见表2，靶点图见图4。

图2 透脓散治疗肉芽肿性乳腺炎潜在靶点韦恩图

图3 PPI蛋白互作网络

图4 网络排名前10的关键靶点

表2 透脓散治疗肉芽肿性乳腺炎的关键靶点信息

2.2.4 GO功能富集及KEGG信号通路富集分析

将潜在靶点提交至DAVID数据库中，按照P＜ 0.05选取富集基因前20名进行分析。GO生物过程137条，主要涉及炎症反应、免疫反应、MAPK 级联和细胞凋亡等，见图5。KEGG 信号通路36 条，主要涉及NF－κB信号通路、Jak－STAT 信号通路、TNF 信号通路、Toll样受体信号通路和T细胞受体信号通路等，见图6。

图5 GO－BP气泡图

图6 KEGG气泡图

2.2.5 绘制通路靶点网络图

根据蛋白与信号通路之间的关系，选取关键靶点，借助Cytoscape 软件，绘制“靶点－通路”图，见图7。图中可见靶点基因IL－6、TNF、NF－κB、Jak－STAT 信号通路与GLM 疾病相关性较高，且一个靶点与多条通路相互作用，体现了多靶点、多通路的共同作用机制。

图7 “靶点－通路”图

2.2.6 核心活性成分、靶点分子对接

利用Autoduck 软件对核心活性成分与核心靶点进行分子对接，一般认为结合能 ＜ −4.25 kcal/mol则提示活性成分与靶蛋白有一定的结合活性，结合能 ＜ −5.0 kcal/mol 则提示活性成分与靶蛋白结合活性良好，结合能 ＜ −7.0 kcal/mol 则提示活性成分与靶蛋白具有较强的结合活性［12］。分子对接结果显示，核心活性成分与靶蛋白的结合能均 ＜ −5.0 kcal/mol，具有良好的结合活性，见表3。用Pymol软件将分子对接进行可视化处理，结果见图8。

图8 分子对接结果图

表3 核心活性成分与核心靶点结合能

3 临床验证试验

3.1 一般资料

依据治疗组比对照组1∶1 比例优效性检验计算公式及文献参考单纯激素治疗乳腺炎的有效率为60%。经PASS26.0 运算操作得出：实现80%的检验效能需要样本量总量72，即治疗组、对照组样本量分别为36。因考虑脱落及失访因素，扩大10%样本量，最终确定总样本量为80例患者。随机选取80例2020年12月—2021 年12 月就诊于山东中医药大学附属医院乳甲外科，病理诊断明确为GLM 患者并收集患者临床基本情况。

3.2 纳入标准

①临床表现及彩超下均符合GLM 症状、经病理诊断确诊为GLM 患者；②自愿参加本试验，并签署知情同意书，能配合完成调查研究者。

3.3 排除标准

①合并其他免疫相关、心血管、内分泌系统等严重原发性疾病者；②合并其他乳房疾病者；③已参加其他正在进行临床研究试验的患者。

3.4 剔除标准

①治疗期间严重不良反应或自动退出者；②资料散失者、脱落病例。

3.5 方法

3.5.1 治疗方法

治疗组口服透脓散汤剂进行治疗；对照组采用甲强龙（40 mg+0.9%NS 100 mL）静滴3 d 后，改为口服甲泼尼龙片，起始剂量20 mg/d，持续口服2 周后减为16 mg/d。两组患者的疗程均为20 d。于治疗前后分别采用空心针穿刺取得原肿块组织。入组患者均知情同意，本研究已取得山东中医药大学附属医院伦理委员会同意，伦理批件号：（2020）伦审第（054）号－KY，临床试验网注册号：ChiCTR2100050368。

3.5.2 检测方法

将提取的组织包埋成病理蜡块后切片，厚度约4 µm，采用免疫组化法染色，中性树胶封片后，置显微镜下观察。

3.6 统计学方法

实验数据用SPSS 26.0 统计软件进行分析，等级资料的对比采用非参数检验（Wilcoxon 秩和检验），治疗前后平均灰度值的对比采用独立样本t检验。P＜ 0.05表示差异具有统计学意义。

4 临床试验结果

4.1 两组患者治疗前后IL－6的表达情况

治疗前，治疗组IL－6 阳性表达率为75.76%，治疗后阳性表达率降为54.55%，差异具有统计学意义（P＜ 0.01）。治疗前，对照组IL－6 阳性表达率为77.78%，治疗后阳性表达率降为74.08%，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。治疗后治疗组IL－6 的阳性表达率与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。见表4和图9。

图9 治疗组治疗前后IL－6阳性表达情况（免疫组化SP法，× 400）

表4 两组患者治疗前后IL－6阳性率的表达情况比较

4.2 两组患者治疗前后TNF的表达情况

治疗前，治疗组TNF 阳性表达率为82.47%，治疗后阳性表达率降为55.46%，差异具有统计学意义（P＜ 0.01）。治疗前，对照组TNF阳性表达率为81.76%，治疗后阳性表达率降为72.54%，治疗前后差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。治疗后治疗组TNF 的阳性表达率与对照组比较，P＜ 0.05。见表5和图10。

表5 治疗前后两组患者TNF阳性率的表达情况比较

图10 治疗组治疗前后TNF阳性表达（免疫组化SP法，× 400）

4.3 两组患者治疗前后IL－1β的表达情况

治疗前，治疗组IL－1β 阳性表达率为79.06%，治疗后，阳性表达率降为52.85%，差异具有统计学意义（P＜ 0.01）。治疗前，对照组IL－1β 阳性表达率为80.76%，治疗后阳性表达率降为73.08%，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。治疗后治疗组IL－1β的阳性表达率与对照组比较，P＜ 0.05。见表6和图11。

表6 两组患者治疗前后IL－1β阳性率的表达情况比较

图11 治疗组治疗前后IL－1β阳性表达（免疫组化SP法，× 400）

5 讨论

中医学认为，本病关键在于气血失和、阴阳失调，初期难以消散，中期散而不聚、难以透发，另有异物日久瘀积，炼液成痰，痰瘀互结形成肿块，与西医炎症及自身免疫而致本病缠绵难愈的病因相契合。故本病治疗应益气和营、调和阴阳、托毒外出。透脓散方中黄芪益气托疮排脓、和营生血，当归、川芎养血和营、调气血之瘀滞，皂角刺、穿山甲活血消痈、软坚散结，全方益气和营、托里透脓，包含托、透治疗思想，可使肿块初期得以消散，中后期早日成脓，透脓外出，病灶由深变浅，趋于局限。

中药复方具有成分多、通路多、靶点多的特点，其作用机制较难分析。而网络药理学可系统分析疾病的发病机制，与中医辨证论治、整体观念的治疗思路相契合［12］。本研究借助网络药理学平台，将“药物、疾病、靶点、通路”相结合，并加以临床验证，为深入研究透脓散治疗GLM的作用机制提供理论及临床支持。

根据网络药理学分析研究，构建“药物－化合物－靶点”图，得到β－谷甾醇、槲皮素、山柰酚、谷甾醇、黄芪皂苷I、黄芪皂苷Ⅳ、黄芪多糖等关键活性化合物，且它们已被证实具有调节炎症因子活性、抗氧化及参与机体自身免疫调节等作用［13－19］，提示透脓散中的活性化合物可能通过参与调节机体免疫反应及炎症反应，促进GLM病情痊愈或趋于好转。

GO 功能富集分析表明，透脓散治疗GLM 可能通过炎症反应、免疫反应、MAPK 级联等途径。KEGG 信号通路富集分析表明，治疗主要涉及NF－κB 信号通路、Jak－STAT 信号通路、TNF 信号通路和T 细胞受体信号通路等，且信号通路间存在多重交互作用。NFκB 信号通路在免疫应答炎症信号通路中起重要作用，游离脂肪酸通过直接与TLR4 结合来激活髓样分化因子88（MyD88）依赖性途径，然后通过MyD88 和白介素1 受体相关激酶（IRAK）激活NF－κB，使p65 进入细胞核并转录激活下游炎症因子IL－6，触发免疫炎症反应［20］。在GLM 发展阶段，CD4+和CD8+细胞呈负相关，TNF－α 与CD4+细胞呈正相关，TNF－α 能诱导NFκB 信号通路的活化，活化调节炎症反应的细胞因子IL－6 的表达，增加炎症细胞的活性及聚集性［21－22］。IFN－γ 和IL－6 通过Jak－STAT 途径发出信号，以IFN－γ优先激活STAT1和IL－6激活STAT3来调节基因表达，IFN－γ 也可以与IL－1β 结合来驱动IL－6 的产生，促进机体免疫炎症进程［23－24］。

分子对接结果显示，透脓散核心活性成分与IL－6、TNF、IL－1β、CCL2、INFG 和ICAM1 具有较好的结合能。临床试验结果显示，透脓散可降低GLM 炎性组织中IL－6、TNF 和IL－1β 的表达，调节局部免疫微环境。结合网络药理学的结果，本研究初步验证了透脓散治疗GLM 可能通过调控NF－κB信号通路下游IL－6、TNF、IL－1β水平来调节免疫炎症反应，然而透脓散治疗肉芽肿性乳腺炎的作用机制仍需大量的体内外实验阐明。