左金丸治疗寒热错杂型溃疡性结肠炎的临床观察及机制研究

★ 吴丽红 李冰莹 徐志强 胡家丽 崔曼曼 肖宵 占传宇 肖曾华 张磊昌（.江西中医药大学 南昌 330004；.江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以黏膜炎症和溃疡为特征的慢性复发性疾病，病位多在结肠与直肠［1］。常见表现为腹泻、腹痛、血液黏性样便，伴全身乏力、食欲不振、发热等［2］。该病反复发作，迁延难愈，近20 年来UC 发病率显著增加，是世界卫生组织认可的难治病之一［3］。目前UC 的病因尚不明确，部分学者认为免疫失衡作为重要原因，与基因突变、遗传易感、脑肠轴紊乱相结合贯穿UC 发病的始终［4］。研究证明PI3K/AKT/mTOR 信号通路参与了UC 发展的关键节点［5-7］，通过抑制PI3K/AKT 通路中相关蛋白的磷酸化水平，可以减少UC 中炎症介质的释放，改善肠黏膜损伤［8］；而mTOR 作为AKT 下游重要的效应学分子，对调控细胞增殖、炎症反应具有重要影响［9］。

溃疡性结肠炎的临床主要用药为5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素与免疫抑制剂。这些药物能够暂时缓解疾病症状，但是长期使用会导致不良反应，如药物依赖性，肾毒性，感染风险增加等［10］。中医药治疗UC 具有很大的优势，既能长期维持缓解期并降低复发率，又能减少胃肠道反应，不易造成并发症。有较多动物实验及临床研究证实了左金丸对UC 具有治疗作用［11-16］，我们运用左金丸治疗UC，是取其“寒温并用、辛开苦降”的组方配伍特点［17］。左金丸药理作用广泛，有较显著的抑菌与抗炎作用，可以增加CD8+T 细胞［18］。吴甜甜等［16］通过动物实验发现左金丸可以通过抑制JAK1/STAT3信号通路从而调节中枢免疫记忆性T 细胞与效应免疫记忆性T 细胞之间的平衡，进而治疗UC。本研究是为了讨论左金丸治疗寒热错杂型溃疡性结肠炎的效果，并运用RT-PCR 检测血清中PI3K、AKT 和mTOR mRNA 表达，初步探讨左金丸通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路调节炎症因子水平，进而治疗UC。现将此次研究所得作以下结果可供参考。

1 研究资料与方法

1.1 研究对象

以尊重受试者隐私及受试者自愿为原则，招募2020 年10 月－2021 年10 月在江西中医药大学附属医院肛肠科住院的溃疡性结肠炎患者48 例。2 组患者性别、年龄、病程、病情轻重程度见表1。所有患者均依照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018 年北京）》［19］活动期轻中度UC 的诊断标准：（1）临床表现主要为脓血便、里急后重、肛门灼热等，症状持续或反复发作；（2）结合肠镜检查和黏膜组织学检查，排除感染性和其他非感染性结肠炎后确诊；（3）改良Mayo 评分为3～10 分。排除标准：（1）病情属于重度者或者处于缓解期；（2）近3 个月或正在使用激素治疗或者生物制剂者；（3）合并严重并发症者，如肠梗阻、中毒性巨结肠、肠上皮癌变、肠穿孔等；（4）处于妊娠期或者哺乳期的妇女；（5）合并严重肝功能、肾功能不全及严重心脑血管疾病者；（6）目前正在参加其他临床试验者。寒热错杂证型诊断标准参照《溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见》［20］制定，主症：（1）腹泻，便下黏液脓血；（2）腹痛；（3）肛门灼热；（4）黏液脓血便。次症：（1）畏寒怕冷；（2）口渴不欲饮；（3）饥不欲食；（4）里急后重。符合主症其中的2 项，次症其中的2 项，即可诊断。

表1 2组患者基线资料比较（s，n=24）

表1 2组患者基线资料比较（s，n=24）

研究对象按照随机数字表法分为对照组及观察组，各24 例，2 组患者性别、年龄、病程、病情轻重程度均无统计学差异（P>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

实验药物对照组予美沙拉嗪肠溶片（葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，国药准字H19980148，规格：0.25 g），每次1 g，每天3 次；观察组予左金丸（江西省中医院制剂室）治疗，黄连30 g，吴茱萸5 g，若见患者腹泻严重，则酌情将黄连用量减至15 g；胸闷少食、便溏者，则在原方基础上加党参10 g、陈皮9 g、白术9 g；噫气不畅，口苦口干伴胃中灼热者，加柴胡9 g、香附9 g、川楝子6 g；心中烦热伴里急后重者，加白头翁9 g、败酱草9 g。服用方法：水煎服，水煮300 mL，每日2剂，每剂150 mL，分早晚温服。2 组疗程均为8 周，随访3 个月。

实验仪器与试剂：RT-PCR 仪（Eppenndorf Centrifuge公司，德国）；RT-PCR 引物（上海生工生物工程）；低温高速离心机（Eppendorf 公司，德国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；96 孔板（耐思，中国）。

2 观察指标

2.1 主要疗效指标

临床总有效率参照《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识（2017 年）》，总有效率＝（临床缓解+临床有效）/该组总人数×100%。其中临床有效的评价标准为总Mayo 评分相对于基线值的降幅≥30%及≥3 分，且便血的分项评分降幅≥1 分或该分项评分为0 分或1 分；临床缓解的评价标准为总Mayo评分≤2 分且无单个分项评分＞1 分；临床无效的评价标准为总Mayo 评分较基线值无下降。

2.2 次要疗效指标

（1）中医证候疗效评价：依照《溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见》，观察腹泻、黏液脓血便、腹痛、四肢倦怠、里急后重5 个单项症状，按照病情轻重程度分别赋值0，2，4，6 分，于治疗前后分别评估4 个单项症状并进行对比。（2）改良Mayo 评分：主要由排便次数、便血程度、内镜下情况及医师总体评价四部分内容构成，总分为0～12 分。见表2。

表2 改良Mayo评分表

（3）Baron 内镜评分标准按照黏膜图像的病变程度分别赋值0，1，2，3 分。（4）理化指标检测患者血清中C 反应蛋白测定（CRP)、血沉（ESR)、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6），并分别进行前后及横向对比。（5）RT-PCR 法检测PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表达采用Trizol 法提取外周血单个核细胞（PBMCs）中的总RNA，紫外分光度法测定其浓度，再将其逆转录为cDNA，按PCR 试剂盒进行扩增，反应条件为95 ℃变性10 s，退火60 ℃30 s，循环40 个，用β-actin 作为内参，基因引物序列。见表3。

表3 基因引物序列

（6）复发率依照2018 年《炎症性肠病诊断与治疗共识意见》，调查患者治疗结束3 个月后疾病复发情况。判定标准如下：缓解期后再度出现腹泻、腹痛、黏液脓血便等情况且在肠镜下发现活动性炎症。复发率＝复发例数/总例数×100%。

3 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组内比较采用配对资料t检验，组间比较采用χ2检验，计数资料以频数（百分比）率表示，P<0.05 代表差异有统计学意义。

4 研究结果

4.1 2 组患者临床疗效比较

经过8 周治疗后2 组患者临床疗效比较，差异具有统计学意义（P=0.033）。见表4。

表4 2组治疗前后临床疗效比较（n=24） 例

4.2 2 组患者治疗前后中医证候各项评分比较

经过8 周治疗，同组治疗后患者腹泻、黏液脓血便、腹痛、四肢倦怠和里急后重积分均显著下降（P<0.05）。观察组患者腹泻、黏液脓血便、四肢倦怠和里急后重积分下降情况低于对照组（P<0.05），可以证明左金丸治疗腹泻、黏液脓血便、四肢倦怠和里急后重有明显效果。观察组患者腹痛积分与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），说明在腹痛改善方面，单纯西医治疗和中医治疗效果相似。见表5。

表5 2组治疗前后中医证候各项评分比较（=24） 分

表5 2组治疗前后中医证候各项评分比较（=24） 分

注：与同组治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，*#P<0.05。

4.3 2 组患者治疗前后肠镜评分及改良Mayo 评分比较

经过8 周治疗，2 组治疗后患者肠镜评分与改良Mayo 评分均显著下降（P<0.05），肠镜下黏膜出血情况均有明显好转，且观察组患者与对照组相比肠镜评分及改良Mayo 评分均降低（P<0.05）。见图1、表6。

图1 2组治疗前后肠镜下图片比较

表6 2组治疗前后肠镜结果及改良Mayo评分比较s，n=24） 分

表6 2组治疗前后肠镜结果及改良Mayo评分比较s，n=24） 分

注：与同组治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

4.4 2 组患者治疗前后CRP 及ESR 水平变化比较

2 组治疗后CRP 及ESR 水平均下降（P<0.05），且观察组患者的CRP 及ESR 水平与对照组相比较均降低（P<0.05）。见表7。

表7 2组治疗前后CRP及ESR水平比较s，n=24）

表7 2组治疗前后CRP及ESR水平比较s，n=24）

注：与同组治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

4.5 2 组患者治疗前后TNF-α 及IL-6 水平变化比较

经过8 周治疗，同组TNF-α 及IL-6 水平均下降（P<0.05），观察组患者的TNF-α 及IL-6 水平与对照组相比均降低（P<0.05），表明左金丸在降低炎症水平、修复受损的肠黏膜方面有显著疗效且优于单纯西医治疗。见表8。

表8 2组治疗前后TNF-α及IL-6水平比较s，n=24） nmol/L

表8 2组治疗前后TNF-α及IL-6水平比较s，n=24） nmol/L

注：与同组治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

4.6 2 组患者治疗前后PI3K mRNA、AKT mRNA和mTOR mRNA 表达水平比较

同组治疗后PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表达水平均下降（P<0.05），且观察组患者的PI3K mRNA、AKT mRNA 和mTOR mRNA 的表达水平与对照组比较均降低（P<0.05）。见图2、图3、图4。

图3 2组治疗前后AKT mRNA表达水平

图4 2组治疗前后mTOR mRNA表达水平

4.7 2 组复发率比较

通过3 个月后对患者进行复查，发现对照组复发8 例，观察组复发3 例，2 组之间具有差异性（P<0.05），说明观察组复发率优于对照组。见表9。

表9 2组复发率比较（n=24） 例

5 讨论

UC 是炎症性肠病的主要亚型之一［21］，其致病因素主要包括环境、感染、免疫、心理因素几个方面。研究表明，免疫应答失调导致的肠黏膜炎症和肠上皮细胞损伤是UC 发病的关键环节［22］。中医将UC 归属为“久痢”“痢疾”“泄泻”“休息痢”“肠澼”“肠风”等范畴，常见病理因素为湿热、热毒、寒湿、气滞、血瘀、瘀热、痰浊、食积，各种因素相互错杂［23］。《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见（2017）》将本病分大肠湿热、热毒炽盛、脾虚湿阻、脾肾阳虚、寒热错杂、阴血亏虚、肝郁脾虚7 个证型，且由于本病虚寒热并见，所以以寒热错杂型病证最为常见和棘手。左金丸作为一个中药复方，出自《丹溪心法·火六》，由黄连与吴茱萸按6∶1 的比例组成，主治肝经火旺之证，黄连清热燥湿解毒，在寒热错杂型UC 治疗中起清热燥湿的功效，吴茱萸散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻，可以治疗UC 患者的泄泻症状。两药相伍，起寒热并用，切中中焦病机，使得气机通畅的作用。文献研究及大量临床试验［17,24-26］表明，在治疗轻中度UC 时，不必拘泥于黄连、吴茱萸6∶1 的药量比例，所以本次临床观察中，我们在治疗以腹泻、脾胃受损为主的病人时，酌情将黄连的药量减至15 g，以达顾护病人脾胃之功。在具体的治疗中，也注重该药方的临证加减。同时，药理研究表明，左金丸中的药物黄连的主要生物碱小檗碱，在对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型中有较高的预防活性［27］，它还可以显著减少急性胃肠炎患者的大便频次，使机型放射性肠综合征的发生率降低。Cui 等［28］发现小檗碱具有调节肠道菌群的物质基础，它可以增加结肠炎大鼠肠道真杆菌和拟杆菌的比例，抑制脱硫弧菌的丰度，缓解肠道菌群的失衡，从而调节T17 和Treg 细胞的失衡。而吴茱萸中的主要生物碱吴茱萸次碱和喹诺酮类生物碱在抗炎、抗肿瘤、促进细胞凋亡和调节肠道菌群等方面起效从而达到治疗肠炎的目的［29-30］。在寒热错杂型溃疡性结肠炎中运用此方，体现了两个药物之间“辛开”“苦降”相协同的治疗机制。

本次研究结果显示，经过8 周治疗，与美沙拉嗪组相比，观察组使用左金丸后，患者腹泻、黏液脓血便、四肢倦怠、里急后重四项中医证候缓解更为有效，肠道症状和血清理化指标改善更为明显，且对临床缓解期患者3 个月随访发现，观察组的复发率更低，患者的生活质量得到显著提高。以上结果证明UC 治疗中左金丸的运用有效缓解了患者临床症状，促进患者肠黏膜的愈合，降低疾病活动性。

基于本课题组的前期网络药理学研究，左金丸通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路在炎症反应、分解代谢过程、血管生成及细胞凋亡等多种过程调节UC。PI3K 作为一种胞内磷脂酰肌醇激酶，参与细胞的增殖、分化、凋亡，与多中国癌症联系密切。AKT，是PI3K 下游的主要效应物， AKT 的活化会磷酸化多种下游因子，进而调节细胞的功能，且其可通过磷酸化下游靶蛋白进而发挥抗凋亡的作用。mTOR 是PI3K/AKT 下游的关键激酶，与肿瘤细胞的增殖、生长、存活和血管生成密切相关。PI3K/AKT/mTOR 信号通路是机体调节细胞增殖分化、凋亡、自噬的重要途径，该通路的过度活化会促使肠上皮细胞大量增殖，引起肠道内炎症因子失衡，导致UC 的发病。同时，炎症的持续刺激也会使该通路过度活化［31］。激活该信号通路会影响重要促炎因子TNF-α 的基因转录，并进一步诱导其他炎症介质如IL-6 的分泌，两种炎症介质的过度产生会导致细胞沉浸在慢性炎症因子环境中，从而导致UC 迁延难愈［32］，所以抑制信号通路的活化与抑制炎症因子和炎症介质的产生和增长对治疗UC 具有重要意义［33-34］。RT-PCR 结果可见，观察组PI3KmRNA、AKTmRNA 和mTORmRNA 的表达显著下调，表明左金丸可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路过度活化，来治疗UC。同时，经过治疗后TNF-α 和IL-6 水平降低，临床症状好转，也体现了促炎因子与该通路之间密切相关。

综上，左金丸能够显著改善UC 患者的肠黏膜损伤，缓解患者临床症状，降低疾病活动度，其作用机制可能与PI3K/AKT/mTOR 信号通路活化水平被抑制，从而炎症介质分泌减少密切相关。