耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌的耐药性分析及碳青霉烯酶初筛试验的应用

闫津津，杨会林，车华涛，陈娟，陈霖（北京大学深圳医院检验科，广东深圳，518000）

铜绿假单胞菌（PA）又称绿脓杆菌，为革兰性阴性菌，广泛分布于自然界，适宜在潮湿环境、空调、医院、水池等环境繁殖，易发生医院感染流行[1]。在人体免疫力低下或菌群失调时更易感染PA[2]。近年来，抗菌药物耐药问题愈发严重，PA 的临床耐药菌株检出率直线上升，甚至出现多药耐药PA。而碳青霉烯类抗菌药物作为临床治疗多重耐药菌感染也不例外，其耐药性药物包括亚胺培南和美罗培南等[3-5]。PA 的耐药机制主要包括碳青霉烯酶的产生、外膜孔蛋白的丢失等[6]。耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌（CRPA）的日益增多使临床感染防控工作更加棘手[7]。研究CRPA 的耐药机制对防控耐药菌株的传播具有重要意义。本研究分析了CRPA 的临床分布、对抗菌药物的耐药性、携带的碳青霉烯酶基因型，以期为临床用药提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 标本来源

收集2020 年1 月至2021 年3 月北京大学深圳医院住院患者临床样本分离的61 株CRPA，菌株于 -80 ℃保存。

1.2 仪器与试剂

Vitek2-Compact 全自动细菌鉴定和药敏系统（法国梅里埃），Vitek MS 质谱仪（法国梅里埃），CO2恒温培养箱（美国Thermo-311），药敏纸片（英国OXIOD），哥伦比亚血平板、MH 平板（广州迪景），碳青霉烯酶缓冲液（珠海迪尔生物），碳青霉烯酶检测试剂盒（长沙中生众捷生物）。

1.3 质控菌株

铜绿假单胞菌ATCC27853 与大肠埃希菌 ATCC25922 为AST 药敏试验质控菌株，来自广东省临床检验中心。产KPC 肺炎克雷伯菌和产NDM 肺炎克雷伯菌为碳青霉烯酶试验质控菌，来自卫生部临床中心提供。

1.4 方法

1.4.1 CRPA 菌株鉴定和药敏试验 采用Vitek-MS 质谱仪和Vitek2-Compact 全自动细菌鉴定和药敏系统，严格按照《全国临床检验操作规程》操作进行细菌分离培养鉴定和药敏试验。药敏试验结果根据美国临床和实验室标准协会2020 版CLSIM10030th 标准判断。

1.4.2 碳青霉烯酶初筛试验（1）EDTA 双纸片增效法：用无菌生理盐水调制麦氏浊度0.5 的待测菌液，在MH 琼脂平板上均匀涂布。用灭菌镊子放置4 张已平衡至室温的亚胺培南药敏纸片，纸片间距>24 mm，纸片距平板边缘>15 mm，在平板背面对应位置分别标记A、B、C、D。将试剂盒中缓冲液R1（乙二胺四乙酸二钠+氢氧化钠）、R2（3-氨基苯硼酸）平衡至室温，A纸片作为空白对照，B 纸片上滴加10 μL 缓冲液R1，C 纸片上滴加10 μL 缓冲液R2，D 纸片上分别滴加 10 μL 缓冲液R1 和R2。孵育18～24 h 后取出平板，测量B、C 纸片抑菌圈直径，分别与A 纸片对比，直径比A 纸片扩大≥5 mm，则分别表示该菌株产金属酶、产丝氨酸酶。（2）免疫层析法：样本和提取缓冲液在EP管中充分混匀后加到检测卡样本孔，样本中碳青霉烯酶与胶体金偶联的碳青霉烯酶单克隆抗体反应，在层析作用下沿着硝酸纤维素膜移动，与固定在检测卡检测线上的KPC、OXA-48、VIM、IMP 和NDM 型碳青霉烯酶单克隆抗体捕获，形成“抗体抗原-金标抗体复合物”，并在测试区相应检测线上出现1 条或多条红线。

1.4.3 CRPA 耐药基因测序 将收集的菌株送至深圳市第一人民医院进行碳青霉烯酶耐药基因（KPC、OXA-50、VIM、IMP 和NDM）检测。

1.5 统计学处理

采用WHONET 5.6、Microsoft Excel 2020 及统计学软件SPSS 26.0 对实验数据进行统计分析，计数资料以菌株数及百分数表示。

2 结果

2.1 CRPA 的科室分布

61 株CRPA 主要分布ICU 科室24 株、普通病房37 株，其中检出率排行前3 的是ICU 24 株（39.34%）、呼吸内科9 株（14.75%）、脑外科7 株（11.48%），其余包括神经内科3 株，肾内科、胸外科、运动医学科各2株，耳鼻喉病区、肝胆胰外科、急诊科、脊柱外科、泌尿外科、血液内科各1 株，以及其他科室6 株。

2.2 CRPA 的标本来源

61 株CRPA 的标本来源以痰液为主，共49 株（80.33%），尿液7 株（11.48%），腹水2 株（3.28%），伤口分泌物、血液、引流物各1 株（1.64%）

2.3 CRPA 耐药性分析

亚胺培南和美罗培南的耐药率较高，分别达100.00%和78.69%，其次为左氧氟沙星和替卡西林/克拉维酸，均为60.66%，而氨基糖苷类药物阿米卡星耐药率最低，为8.20%。其余抗菌药物耐药率见表1。

2.4 CRPA 碳青霉烯酶初筛试验结果

61 株CRPA 碳青霉烯酶初筛试验检测出金属β-内酰胺酶型阳性菌株3 株（1 株既产丝氨酸酶又产金属酶），丝氨酸酶型阴性菌株29 株；CPPA 耐药基因测序结果显示，有3 株CRPA 携带金属β-内酰胺酶IMP-45 基因，32 株CRPA 携带丝氨酸酶OXA-50 基因，未检出KPC、GES 丝氨酸酶型及NDM、VIM 金属β-内酰胺酶酶型基因。见表2、图1。

图1 CRPA 碳青霉烯酶初筛试验结果

表2 61 株CRPA 碳青霉烯酶初筛试验结果

3 讨论

PA 可导致机体各个部位的感染，肺泡灌洗液、痰液、尿液等其他分泌物均可分离出该菌株[8-9]。本组资料显示，61 株CRPA 主要分布ICU 24 株（39.34%）、呼吸内科9 株（14.75%）、脑外科7 株（11.48%）。主要原因可能有：以上科室患者往往病情严重、病程较长，需频繁接受静脉置管、气管插管等有创伤性的侵袭性操作；同时部分患者长期使用广谱抗菌药物，导致自身菌群失调、PA 机会性感染[10-12]。ICU 科室危重患者多，CRPA 在该科室分布较多，临床应重视对CRPA 的防控工作，预防临床感染的发生，有助于加快患者的治疗进度。有研究显示，机体呼吸系统易感染PA，其易定植于人体呼吸道，因此该类菌株为患者呼吸道感染的主要病原菌[13]。本研究结果与之描述一致，CRPA 的标本来源以痰液为主，提示CRPA 易感染的部位为呼吸系统。

2015 年一项Meta 分析报道，PA 碳青霉烯耐药率为8.7%～50.4%[14]。研究显示[15]，2018 年临床分离菌中PA 排名第3，分离率达10%，PA 对亚胺培南的耐药率达30.7%。CRPA 中，最常引起碳青霉烯类耐药的原因是MexXY-OprM 外排泵表达增加或过表达，其次是菌株OprD 基因减少或缺失，以及MexAB-oprM 有没有表达增加或过表达[16]。本研究药敏试验显示，亚胺培南和美罗培南的耐药率较高，分别达100.00%和78.69%；其次为左氧氟沙星和替卡西林/克拉维酸，均为60.66%；而氨基糖苷类药物阿米卡星耐药率最低，为8.20%。CRPA 对氨基糖苷类药物耐药率最低，可能是其在临床应用较少或与抗菌药物联合应用，延缓其耐药率的升高[17-18]。Abdallah 等[19]的研究也表明，在短期内控制碳青霉烯类药物的应用，PA 对碳青霉烯类药物耐药率有所下降。鉴于此，在CRPA 感染治疗中，应合理使用碳青霉烯类药物或进行联合用药，如β-内酰胺酶联合氨基糖苷类，或β-内酰胺酶联合喹诺酮类[20]。根据氨基酸序列的不同，碳青霉烯酶按内酰胺酶分类可分为A 类丝氨酸酶、D 类丝氨酸酶和B 类金属β-内酰胺酶型。本研究检测出金属β-内酰胺酶型阳性菌株3 株，未检出其他类别金属酶型基因，说明CPPA 中金属酶的型别主要为IMP-45；且CPPA 耐药基因主要携带丝氨酸酶OXA-50 基因，但其是否属于固有耐药，还需更多的数据验证。

综上，CRPA 主要分布于ICU，以痰液标本为主，其菌株多携带丝氨酸酶OXA-50 基因；应针对不同科室加强医院防控措施。医院应重视对ICU 患者的细菌鉴定，临床应根据药敏试验及患者的病情合理应用抗菌药物，从而完善医院感染防控措施，延缓CRPA 耐药率的升高、控制CRPA 传播。本研究不足之处：由于检测条件有限，仅检测部分常见抗菌药物的药敏结果和具有代表性的耐药基因，未检测多黏菌素等，药敏数据和耐药基因数据具有一定局限性，其临床价值受限，日后需对CRPA 的耐药机制及其携带的基因型进行更深入的研究。