胃癌精准诊断的核酸生物标志物研究进展

李巧楠,王 婷,张焜和

(南昌大学第一附属医院消化内科,江西省消化疾病研究所,南昌 330006)

胃癌是全球第五大常见癌症,也是第四大癌症相关死因,估计2020年全球新发胃癌病例超过100万例,死亡病例估计76.9万例[1],严重威胁人类健康。手术切除仍是胃癌最有效的治疗方法,但因早期症状不明显,胃癌诊断时多数为中晚期,错过最佳手术时机,5年生存率仍不理想。目前胃癌诊断依赖于胃镜检查和活检,但其有创性、费用高、资源不足和较高的技术要求,难以用于胃癌的筛查,因而胃癌的早期诊断仍面临巨大挑战。因此,通过精准诊断,实现精准治疗,可能是目前提高胃癌疗效、改善预后的关键途径。

胃癌精准诊断需要借助相关分子标志物的检测和应用。然而,传统的血清肿瘤标志物,包括癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原125(CA125)和糖类抗原72-4(CA72-4),在胃癌的诊断中价值有限[2]。为了改变胃癌缺乏有效标志物的现状,近年来开展了大量胃癌相关核酸分子及其临床诊疗意义的研究,包括微小RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、外泌体源性RNA、Piwi蛋白互作RNA(piRNA)、循环游离DNA(cfDNA)和循环肿瘤DNA(ctDNA)等。结果显示它们对胃癌的诊断、转移、临床分期、复发监测、预后评判等具有不同价值,在胃癌的精准诊断方面有良好的潜在应用价值。为此,本文就上述核酸分子标志物在胃癌精准诊断方面的研究进展进行综述。

1 miRNA

miRNA是含有18～25个核苷酸的非编码RNA,能调控基因表达,在细胞和组织的增殖、分化、发育和凋亡等生物学过程中发挥重要作用[3]。miRNA作为新型生物标志物,在胃癌的诊断和治疗中具有较大潜在价值。

miRNA在胃癌组织中的表达水平可以发生明显改变,并与胃癌的生物学行为有关。JEDDI等[4]发现,miR-200a和miR-28在胃癌组织中表达水平显著下调,且miR-28表达越低,胃癌体积越大、组织学分级越高、淋巴结和远端转移发生率越高。BAO等[5]报道miR-148a-3p在胃癌组织和血浆中均显著下调,过表达miR-148a-3p可以抑制胃癌细胞的增殖表型、转移表型和癌干细胞样特性,从而抑制胃癌的进展。miRNA可通过肿瘤相关分子或信号通路而影响胃癌的生物学行为,如胃癌中miR-1292-5p可以抑制原癌蛋白DEK而影响胃癌细胞的生长、迁移和侵袭[6];miR-653-5p通过作用细胞因子信号转导抑制因子6(SOCS6)促进胃癌细胞增殖和转移[7],表明miRNA可作为治疗靶点的候选者,从而为胃癌的治疗提供新的思路。

血浆和尿液中的miRNA在胃癌精准诊断中具有重要的潜在应用价值,特别是早期胃癌。CHEN等[8]发现,血浆中miR-421表达上调发生于胃癌前病变和胃癌早期,其诊断胃癌的AUC、敏感度、准确度优于传统肿瘤标志物(CEA、CA125、CA153、CA211和CA50),而其特异度高于CEA、CA153和CA50(均P<0.05)。此外,IWASAKI等[9]检测了胃癌和健康对照者尿液中miRNA的表达水平,发现miR-6807-5p和miR-6856-5p在胃癌患者中表达上调,术后下降到低于检测下限,将它们与幽门螺杆菌感染状态联合检测,对胃癌有良好诊断价值(AUC=0.885),且可以区分Ⅰ期胃癌和健康对照者(AUC=0.748)。因此,miRNA作为诊断早期胃癌的新型生物标志物具有较大潜力,能鉴别胃癌与其他胃良性疾病。

2 circRNA

circRNA是一类闭合的非编码RNA,无5′端帽状结构和3′端polyA结构[10]。因闭合的环状结构而不易被RNA酶降解,circRNA在人体细胞中具有高稳定性、广泛性、高保存性[11],有望成为癌症的新型生物标志物。

2013年,HANSEN等[12]首次发现circRNA可作为miRNA的海绵而参与基因表达和调控,并影响转录后过程。此后不少研究证实circRNA主要作为miRNA的海绵而发挥作用。DENG等[13]发现circRHOBTB3充当miR-654-3p的海绵,通过激活p21信号通路抑制胃癌的生长。LIU等[14]也发现circ-MAT2BGC在胃癌细胞中显著升高,并作为miR-515-5p的海绵增加HIF-1α表达,参与circ-MAT2B/miR-515-5p/HIF-1α的正调控网络。CAO等[15]证实hsa_circ_0008259(circLMO7)作为miR-30a-3p海绵影响WNT2/β-Catenin通路,促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外,circRNA还能通过抑制蛋白活性发挥抑癌作用。ZHANG等[16]在小鼠肿瘤模型上发现,hsa_circ_0061137(circDIDO1)编码的529aa蛋白能直接与聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)相互作用而抑制其活性;另外该研究还发现circDIDO1与过氧化还原蛋白2(PRDX2)特异性结合,促进RBX1介导的PRDX2泛素化和降解,从而导致其下游信号通路失活而发挥抑癌作用,进一步说明circDIDO1发挥抑制胃癌作用,这为胃癌诊断和治疗提供了新的靶点。

circRNA不但与胃癌的生物学行为密切相关,其在胃癌患者的体液和癌组织中的表达水平也发生改变,可作为潜在的胃癌标志物。LI等[17]分析了胃癌患者与健康对照血浆中的circRNA差异表达谱,发现hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276对胃癌有良好的诊断价值,两者联合的AUC为0.912,灵敏度为0.847,特异度为0.966,且它们在胃癌组织中的低表达与远处转移有关,血清水平低者生存时间更短,术后恢复正常者预后更好。XU等[18]也发现circ_0004771在胃癌组织中表达上调,其血浆水平明显高于浅表性胃炎和正常对照,诊断胃癌的总AUC为0.831,鉴别胃癌与浅表性胃炎的AUC为0.845,胃癌术后血清circ_0004771恢复正常,复发后再度升高,可见circ_0004771能良好鉴别胃癌与胃良性病变,并且有望成为一种新的血清标志物监测胃癌状态。

3 lncRNA

lncRNA是长度超过200个核苷酸的RNA。大多数lncRNA通常不是翻译成蛋白质,而是作为功能性RNA分子参与基因表达调节、染色质重塑、细胞分化和胚胎发育[19]。

lncRNA广泛存在于胃癌患者的癌组织和体液中。LIU等[20]发现,在胃癌组织、细胞系和血清中lncRNA HOXA11-AS表达上调,其中其血清水平降低与肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移呈负相关,诊断胃癌的AUC高达0.924。KE等[21]发现4种lncRNA(AK001058、INHBA-AS1、MIR4435-2HG和CEBPA-AS1)在胃癌患者的血浆中显著升高,联合诊断胃癌的AUC高达0.921。FENG等[22]使用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测胃癌患者、息肉患者和正常对照组血清中lncRNA B3GALT5-AS1的表达水平发现,胃癌患者的B3GALT5-AS1水平明显高于正常人,AUC为0.816,B3GALT5-AS1可作为区分胃癌患者与健康人的诊断标志物。由此可见,lncRNA在胃癌患者组织和体液中高表达,是一种有潜力的胃癌的非侵袭性诊断标志物。

许多lncRNA可作为miRNA的海绵,在胃癌的发生发展中发挥作用。JIANG等[23]发现lncRNA KLF3-AS1在胃癌细胞中表达下调,其作为miR-223的海绵抑制胃癌细胞增殖、生长,且能增强胃癌细胞对顺铂的敏感性,但在胃癌中的具体分子机制仍需进一步研究。ZHAO等[24]发现IncRNA LINC00339在胃癌中过度表达,可充当miR-539的海绵调节SRY-Box 9(SOX9),在胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭中起着关键作用。此外,LIU等[25]发现与正常对照组相比,lncRNA RP11-874J12.4在胃癌组织和细胞系中表达升高,作为miR-3972的海绵而调节RP11-874J12.4/miR-3972/SSR2轴增强MKN-45和AGS胃癌细胞对化疗药物抵抗力,可作为胃癌诊断和治疗的靶点。

4 外泌体源性RNA

外泌体是细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的囊泡物质,平均直径为100 nm[26],其中含有蛋白、脂质、非编码RNA等物质。外泌体于20世纪80年代被提出[27],认为外泌体是细胞内的“垃圾袋”,可以通过转移其中特定物质来进行局部和远处的细胞间通信而参与许多生物过程。其有可能成为胃癌精准诊断的标志物,近年来已成为研究热点。

外泌体来源的lncRNA对胃癌的诊断有较大的价值。早期胃癌的诊断备受关注,LIN等[28]在早期胃癌血浆中发现一种特异性外泌体lncRNA——lncUEGC1,鉴别早期胃癌与健康个体和慢性萎缩性胃炎的AUC分别高达0.8760和0.8406,说明lncUEGC1有望成为早期胃癌的新型标志物。ZHAO等[29]发现,与正常健康人比较,外泌体lncRNA HOTTIP在胃癌血清中表达上调,诊断胃癌的AUC为0.827,显著高于CEA、CA 19-9和CA72-4;进一步发现HOTTIP的血清水平还与胃癌的浸润深度、TNM分期和生存期显著相关,可能具有诊断和预后评价的双重价值。另有研究[30]发现外泌体中转录因子FOXM1相关的lncRNA(FRLnc1)在胃癌细胞、组织和血清中的表达均上调,在血清外泌体中尤为明显(诊断胃癌的AUC为0.863),并证实胃癌细胞来源的外泌体通过转运FRLnc1促进胃癌的生长和转移。

外泌体来源的circRNA也与胃癌相关,可能是胃癌潜在的标志物。有研究[31]发现胃癌组织和血清中外泌体circSHKBP1(hsa_circ_0000936)的表达增加,其水平与TNM分期和生存率呈负相关,且在胃癌切除术后表达水平明显下降;进一步研究发现circSHKBP1可调节miR-582-3p/HUR/VEGF途径,抑制HSP90降解,从而促进胃癌进展,有可能成为胃癌治疗探索的新方向。ZHENG等[32]发现,与正常对照组相比,外泌体hsa_circ_0015286在胃癌组织、血浆和癌细胞中的表达水平均升高,诊断胃癌的AUC分别为0.778、0.673和0.665,三者联合检测AUC可提高到0.843。由此推断外泌体来源的circRNA在胃癌中可作为诊断、治疗和判断预后的新型生物标志物。

外泌体来源的miRNA在胃癌诊疗中的意义已有不少报道,其对胃癌的诊断价值优于血清miRNA,并与胃癌的转移、分期等相关。WEI等[33]发现胃癌血清外泌体中的miR-15b-3p高于正常对照,其诊断胃癌的AUC为0.820,优于癌组织和血清中miR-15b-3p对胃癌的诊断价值(AUC分别为0.674和0.642),还发现血清中外泌体源性miR-15b-3p可以预测胃癌患者的总生存期,外泌体源性miR-15b-3p诊断胃癌具有更高的灵敏度,同时也是胃癌预后指标。ZHENG等[34]检测了218例血清样本的外泌体miRNA-590-5p表达水平,其在健康对照组、早期(Ⅰ和Ⅱ)胃癌组和晚期(Ⅲ)胃癌组的表达水平使用2-ΔΔCT法计算分别为30.34±6.35、6.19±0.81和2.9±0.19,诊断胃癌的AUC为0.810,敏感度为63.7%,特异度为86.0%,并与胃癌的浸润深度、TNM分期和生存期密切相关。因此,外泌体来源的miRNA在胃癌的诊断和预后中有重要价值。

与血浆或血清中的RNA分子相比,外泌体中的RNA分子具有以下优点:外泌体的含量与供体细胞的含量密切相关,使基于外泌体的RNA分子检测具有更高的特异性;外泌体稳定存在于各种生物液体中,其中的RNA分子可免受RNA酶的降解。因此,外泌体来源的RNA分子作生物标志物有良好的诊断价值。

5 piRNA

piRNA是具有21～35个核苷酸的一类小非编码RNA,与piwi家族蛋白相互作用。人类中有30000多种piRNA基因,在转座子沉默、表观遗传调控和生殖系发育中发挥作用[35]。近年来,有研究[36]表明piRNA在胃癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌和肺癌等各种癌症中异常表达。

VINASCO SANDOVAL等[37]在胃癌组织中发现698个piRNA,其中piR-48966、piR-49145、piR-31335在胃癌与癌旁组织间存在差异表达。CHENG等[38]使用qRT-PCR发现piR-823在胃癌组织中的表达水平显著低于非癌组织,增加piR-823表达量,细胞生长受到抑制,说明piR-823在胃癌中有重要价值,但这只停留在小鼠模型阶段。另一项研究[39]发现,胃癌患者胃液中的piR-1245水平高于健康对照,区分两者的AUC为0.885,进一步发现胃液中piR-1245高表达的胃癌患者的总生存期和无进展生存期较差。因此,piRNA可能是有前途的诊断和预后生物标志物,但目前为止,piRNA与胃癌发生发展的机制尚不明确,仍需要进一步研究。

6 ctDNA和cfDNA

源于肿瘤细胞的DNA片段进入血液循环即为ctDNA[40],与血液中的其他游离DNA共同构成cfDNA。cfDNA可以在健康人的血清或血浆中检测到,但大多数cfDNA来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞。

早在2011年,有研究[41]发现胃癌患者血浆cfDNA水平比正常健康组高2～3倍。PARK等[42]在54例胃癌患者和59名匹配的健康对照中,发现胃癌组血浆cfDNA的平均水平比对照组高出2.4倍,cfDNA在胃癌患者血浆中高表达,这为诊断胃癌带来了可能性。ZHANG等[43]检测了胃癌患者术前和术后cfDNA浓度和完整性,发现胃癌患者的术前cfDNA水平明显高于术后,术后2种指标也明显高于健康对照组,表明血浆cfDNA浓度测定可能适用于检测胃癌。HUANG等[44]分析了血浆cfDNA提取物中的ssDNA与dsDNA的比值,发现胃癌患者这一比值明显低于健康对照组,诊断胃癌的AUC为0.923,且该比值在不可切除胃癌明显低于可切除胃癌,表明该比值在胃癌诊断有较大的潜力,对能否行外科手术有预测价值,此外,该比值还不受溶血和反复冻融的影响,可能是一项稳定性好的指标。值得注意的是,在一项前瞻性研究中,CABEL等[45]使用PCR技术检测了非转移性胃腺癌患者围手术期化疗期间血浆ctDNA水平,发现术前胃癌患者中没有一个具有可检测的ctDNA水平(N=0/18),术后只有一个患者具有可检测的ctDNA水平(1/13),认为ctDNA检测的敏感性较差,不是预测非转移性胃癌化疗和术后复发疗效的有用工具,然而,这种低检出率背后的机制仍不明确,可能需要进一步研究和开发更敏感的检测技术。

cfDNA和ctDNA用作肿瘤液体活检的检材,具有重复性好、创伤小等特点[46],有望成为胃癌精准诊断的生物标志物,但将其转化为临床实际应用仍面临巨大挑战。ctDNA的检测和定量受其不稳定性和动态变化的限制,cfDNA水平在健康受试者中也升高,提示缺乏癌症特异性,因此,有必要改进ctDNA和cfDNA的检测技术,以获得更有价值的检测结果。此外,虽然cfDNA和ctDNA能带来肿瘤相关信息,但它们与原发肿瘤之间有一定差异,并不能完全代替原发肿瘤,只能发挥补充作用。

7 总结与展望

CEA等传统血清肿瘤标志物,尽管在胃癌的分期和术后复发监测方面有一定价值,对胃癌的诊断价值非常有限。新型核酸标志物,包括microRNA、circRNA、lncRNA、外泌体源性RNA、piRNA等,与胃癌的生物学行为和疾病状态有较密切的关系,诊断价值优于传统血清生物标志物,有可能在胃癌的精准诊断中发挥重要作用,但相关研究目前尚处于初级阶段,距离临床应用还有较大差距。就临床角度而言,目前的研究一般为小样本的单中心研究,需要大样本、多中心的前瞻性研究验证它们的价值。从技术层面来看,涉及的检测技术多数较为复杂而临床实用性差,需要不断优化和简化以适应临床需要。另外,由于胃癌的异质性,单个肿瘤标志物对胃癌的诊断价值不一定理想,可能需要2种或2种以上指标联合,才能进行更精准的诊断,这进一步增加了研究的难度。尽管如此,由于血液肿瘤标志物检测具有简便、易于重复、创伤小等优点,有理由相信,随着研究的深入和技术的改进,生物标志物将为胃癌的精准诊断提供重要支撑。