黑色素细胞Toll 样受体在色素性皮肤病中的作用

朱宇琪，宋秀祖

（浙江中医药大学附属杭州第三医院，浙江 杭州 310009）

固有免疫是机体固有的、抵御病原体入侵的第一道屏障，巨噬细胞和中性粒细胞等参与其中，Toll样受体（TLR）在固有免疫中扮演重要角色。当致病因子如脂多糖（LPS）、脂磷壁酸（Lta）等刺激细胞TLR 时，会诱导产生炎性细胞因子和趋化因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β和巨噬细胞炎性蛋白2（MIP2）等，以激活炎性反应抵御病原体入侵[1]。近年来研究表明，TLR 在黑色素细胞中功能性表达，参与黑色素合成和黑素小体转运，并在黄褐斑和白癜风的发病中发挥重要作用。本文围绕TLR 在黑色素细胞中异常表达对色素性皮肤病发病的影响进行综述。

1 TLR 的结构和功能

TLR 是一类参与固有免疫的跨膜蛋白。哺乳动物TLR 家族包括13 名成员，其中人类由TLR1～TLR10等10 名成员组成[2]。人类的固有免疫系统高度保守，可通过TLR 识别病原体相关分子模式（PAMP）对入侵机体的病原体做出即时反应。在获得性免疫中，树突状细胞中的TLR 信号也参与了初始T 细胞的激活过程[3]。TLR 在免疫细胞以外的细胞中也有表达，包括：角质形成细胞、黑色素细胞和朗格汉斯细胞等。Yu 等[4]用特异性引物对体外扩增的正常人黑色素细胞进行mRNA 检测：发现人黑色素细胞构成性表达TLR1、2、3、4、6、7 和9，但不表达TLR 5、8和10。用抗人TLR 蛋白的特异性抗体进行流式细胞术和免疫荧光检测发现人黑色素细胞表达TLR蛋白，证实了TLR 在皮肤黑色素细胞中的表达。

TLR 识别的配体主要有：微生物天然成分、天然物质的合成类似物、小分子化合物，以及无菌炎性反应期间宿主细胞释放的内源性成分等[5]。细胞表面TLR 主要识别微生物膜成分，如脂质、脂蛋白和蛋白质。单个TLR 可识别多种配体来触发免疫反应[6]。TLR 可通过其细胞外结构域与多种微生物PAMP 相互作用。在TLR 刺激下，核转录因子-κB（NF-κB）的激活和干扰素（IFN）-调节因子3 途径分别启动了促炎细胞因子（如IL-1 和TNF-α）的产生和Ⅰ型IFN（IFN-α 和IFN-β）的产生。因此TLR在早期宿主抵御入侵病原体的防御中起着至关重要的作用[5]。TLR 信号的激活需要TLR 的同源二聚化或异源二聚化，或与核心受体形成“m”形二聚体，夹在配体分子结构之间，以促进细胞内Toll/IL-1 受体（TIR）结构域的二聚化，并触发下游信号级联反应。TLR 的细胞内TIR 结构域二聚化的同时招募含有TIR 结构域的适配蛋白，如髓样分化初级应答基因88 （MyD88）、含TIR 结构域的适配蛋白（TIRAP）、诱导IFN-β 的含有TIR 结构域的衔接子（TRIF）和TRIF 相关适配分子（TRAM）。根据适配蛋白的使用情况，TLR 信号又分为MyD88 依赖通路和TRIF 依赖通路。除了TLR3，所有的TLR 都使用MyD88 依赖的途径来启动信号传递，而TLR4 则利用MyD88 和TRIF 途径[7]。

当刺激人黑色素细胞TLR 时，促炎细胞因子（IL-8、IL-6）和趋化因子[CC 趋化因子配体2（CCL2）、CCL3、CCL5]的释放显著增加。而触发TLR 2、3、4、7和9 则导致NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）的磷酸化和NF-κB 亚基p65 的核移位，表明培养的人黑色素细胞表达功能性TLR2、3、4、7 和9，且NF-κB 通路参与TLR2、3、4、7 和9 的信号转导反应，这也解释了众多促炎基因被激活的原因：TLRs 使人黑色素细胞成为皮肤固有免疫的活跃分子，参与了色素性皮肤病的发病[4]。

2 TLR 与黄褐斑

2.1 TLR2 与黄褐斑 TLR2 在健康皮肤中不表达或弱阳性表达，但在黄褐斑皮损处呈阳性表达，且表达明显上调，表明黄褐斑发病中的炎性反应可能与TLR2 介导的免疫反应相关[8]。Koike 等[9]研究表明，TLR2 激动剂单核细胞增生李斯特氏菌热灭活制剂（HKLM）通过促进人黑色素细胞的黑色素生成基因的表达，包括增加酪氨酸酶（TYR）的活性和表达，上调小眼畸形相关转录因子（MITF）、TYR、多巴色素互变异构酶（DCT）的mRNA 表达，导致细胞外黑色素和原本数量稳定的细胞内黑色素增加，证明TLR2 通过促进黑色素细胞黑色素生成来参与固有免疫系统的反应。黑素小体成熟和运输的基础是膜运输和囊泡转化。人表皮包括微生物群在内的微环境表达TLR 以感知外界信号，从而诱导细胞因子和抗菌肽保护人体。其中TLR2 促进了人表皮黑色素细胞Rab11A 的表达，并利用与Rab11a 相关的黑素小体转运，来将黑素小体从黑色素细胞向邻近角质形成细胞转移，从而影响皮肤色素沉着及阐明炎性反应后色素沉着的过程[10]。

2.2 TLR3 与黄褐斑 TLR3 激动剂聚肌胞苷酸[Poly（I：C）]通过TRIF 和线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）信号通路诱导Rab27A 的表达，增加了黑素小体向膜周区域的转运和向角质形成细胞的转移，证明TLR3 信号通过促进黑素小体转移到角质形成细胞来响应固有免疫系统的激活[9，11]。Koike 等[12]研究表明TLR3 刺激激活Ras 同源基因家族成员A（RHOA）和细胞分裂周期因子42（CDC42）的表达，肌动蛋白应力纤维和丝状伪足的形成分别发生改变，来诱导细胞内吞作用，从而促进黑素小体进入角质形成细胞引起色素沉着。

2.3 TLR4 与黄褐斑 TLR4 在健康皮肤中不表达，但在黄褐斑皮损处表达明显上调。表明黄褐斑发病机制中的炎性反应除了TLR2 外，可能也与TLR4介导的免疫反应相关[8]。人黑色素细胞在生理条件下表达TLR4 及其接头分子CD14 和MyD88，而TLR4 和MyD88 的表达又受到LPS 的调节。其中CD14 作为接头分子通过TLR4 增强LPS 的信号敏感性，而MyD88 又是TLR4 细胞内信号转导所必需的。LPS 可诱导人黑色素细胞黑色素合成但却以浓度依赖的方式抑制黑色素细胞增殖，表明LPS 诱导的TLR4 表达可能在微生物诱导的黑色素合成中发挥作用[13]。Tam 等[14]研究表明在深肤色的黑色素细胞中TLR4 mRNA 水平高于浅肤色的黑色素细胞。而黑色素细胞TLR4mRNA 的表达受LPS 参与的NF-κB 通路调控，通路激活可增加黑色素细胞TLR4mRNA 的表达，并增强NF-κB p50 和p65 的DNA 结合活性，表明黑色素生成参与正常表皮黑色素细胞的免疫调节作用。Song 等[15]研究表明，静息状态的新生儿黑色素细胞（NHMs）不表达TLR4，但LPS 刺激可诱导TLR4 表达，从而增加细胞色素沉着，并诱导局部炎性反应。而反复紫外线照射，特别是户外紫外线（UVB）治疗后，NHMs TLR4 的mRNA和蛋白表达均显著高于经LPS 治疗后。表明黑色素细胞中的TLR4 信号通路与UVB 诱导的免疫调节之间可能存在关联。Takabe 等[16]研究表明黑色素细胞周围完整的透明质酸涂层可以保护细胞免受紫外线辐射（UVR）等各种因素的伤害，当透明质酸涂层破裂时则通过NF-κB 激活增加UVB 诱导的TLR-4 受体信号和促炎介质IL-6、IL-8、CXC 趋化因子配体1（CXCL1）和CXCL10 的表达，透明质酸涂层的反复损伤参与激活UVB 诱导的持续反应导致炎性发生。

2.4 TLR9 与黄褐斑 TLR9 激动剂ODN2006 刺激以剂量依赖性方式降低正常人皮肤黑色素复苏细胞（PIG1）的活力，并提高促炎细胞因子TNF-α、IL-6 和IL-8 的产生。ODN2006 可不同程度地调节PIG1 黑色素细胞中PMEL、TYR 和TLR9 的表达，并以时间依赖性方式增加TLR9 表达，UVB 照射对这一过程具有叠加效应。经ODN2006 刺激的TLR9可进一步激活NF-κB 促进黑色素细胞的黑色素合成，提示在微生物诱导的黑色素合成中TLR9 可能发挥作用[17]。

3 TLR 与白癜风

3.1 TLR3 与白癜风 Zhang 等[18]采用流式细胞术检测黑色素细胞细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达，发现坏死的角质形成细胞释放的RNA 可刺激黑色素细胞ICAM-1 的表达，并诱导黑色素细胞的促炎基因表达。而TLR3 可作为受体与受损细胞中释放出来RNA 相互作用。这表明TLR3 可能通过诱导人黑色素细胞ICAM-1 等促炎基因表达，直接调节黑色素细胞功能及与免疫细胞间的相互作用，并参与皮肤物理创伤后白癜风的发病机制。Yu 等[19]用免疫荧光法检测体外扩增的人表皮黑色素细胞TLR3 后发现，人黑色素细胞表达构成性和诱导性TLR3，这表明人黑色素细胞可能通过TLR3 来识别病毒来源的致病基序。进一步研究表明，黑色素细胞对双链核糖核酸（dsRNA）的反应性诱导凋亡作用依赖于TLR3[20]。TLR3 介导的黑色素细胞凋亡需要自分泌IFN-β。病毒感染曾被认为是白癜风中黑色素细胞破坏的诱因，推测病毒dsRNA 通过激活人黑色素细胞中的TLR3 并自分泌IFN-β 来诱导黑色素细胞的凋亡。

3.2 TLR7 与白癜风 Yu 等[3]研究表明，与正常黑色素细胞比较，白癜风皮损周围皮肤的黑色素细胞凋亡率显著升高，白癜风黑色素细胞分泌的IL-6、IL-8 和可溶性ICAM-1（sICAM-1）也明显增多，但白癜风黑色素细胞的酪氨酸酶活性及黑色素含量均显著低于正常黑色素细胞。白癜风黑色素细胞TLR7 表达明显高于正常黑色素细胞，表明TLR7 可能与白癜风黑色素细胞的功能紊乱相关[3]。Traks 等[21]研究表明，TLR7 单核苷酸多态性（SNP）与白癜风易感性存在关联，表明除了部分炎症性皮肤病以外，TLR 还影响白癜风的疾病发展。TLR7 激动剂咪喹莫特的局部使用可能引起局限性白癜风或白癜风样色素减退[22]。Kang 等[23]研究表明，咪喹莫特对人黑色素细胞有直接作用，降低了小眼症相关转录因子（MITF）和酪氨酸酶蛋白的表达，从而导致色素的减少。同时，经咪喹莫特刺激的黑色素细胞生长受到抑制。因此，外用咪喹莫特引起的白癜风的发病机制可能与咪喹莫特通过TLR7 依赖性机制抑制人黑色素细胞增殖和黑色素生成相关。

3.3 TLR9 与白癜风 Yu 等[3]研究表明，TLR9 在白癜风黑色素细胞中表达增加，可能与白癜风的发病机制有关。TLR7 和TLR9 有相似的结构和功能，并分别通过识别自身RNA 参与自身免疫，但在自身免疫性疾病中的作用可能有所不同。在系统性红斑狼疮（SLE）的小鼠模型中，TLR9 基因缺陷小鼠的自身免疫性疾病加重，而TLR7 基因缺陷小鼠的病情则有所改善，二者起着相反的炎性反应和调节作用[24]。SLE患者B 细胞中TLR9 的低反应性可能代表某种保护机制的丧失，从而导致自身免疫的启动或增强[25]。TLR 交易伴随基因UNC93B1 通过招募syntenin-1以抑制TLR7 信号并防止自身免疫，但不限制TLR9的信号转导[25]。因此推测在白癜风患者对黑色素细胞的自身免疫作用下，这2 种TLR 的表达增加可能是由于皮损内环境稳态的竞争所致[26]。

综上，本文对TLR 在黑色素细胞中异常表达与色素性皮肤病发病的相关性进行了综述与讨论。TLR 可通过诱导相关基因的表达来调节黑色素细胞黑色素生成和炎性因子释放，并参与免疫反应。黑色素细胞及黑色素生成过程的异常与色素性皮肤病紧密相关，黄褐斑的发病一般认为与黑色素细胞黑色素生成增加有关，而白癜风则存在功能性黑色素细胞的缺失。TLR 也被证明在色素性皮肤病中的表达发生改变，其中TLR2 和TLR4 在黄褐斑发病中发挥作用，TLR3、7 和9 均参与白癜风的发病，但TLR 在其中参与的具体环节尚未完全阐明，对TLR 及其对黑色素细胞影响的进一步深入研究，对色素性皮肤病的发病机制的阐明有重要意义。