肝内微环境诱导的自噬在非酒精性脂肪性肝病中的作用

寇萱萱, 张 华, 邓婧鑫, 张建刚

兰州大学基础医学院病理学研究所, 兰州 730000

肝脏是人体最大的代谢器官,肝细胞是肝脏发挥功能的主要效应细胞,与肝窦内皮细胞、Kupffer细胞、肝星状细胞(HSC)、免疫细胞及各种分泌因子,如生长因子、细胞因子和趋化因子、细胞外基质等共同构成肝脏内的微环境。器官局部微环境异常在疾病发生发展中发挥着重要的作用。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是从非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver,NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的一系列肝脏异常病变,病程不定,最终可演变为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。NAFLD具有显著的微环境异常的病理特征,包括高脂、压力、缺氧等。研究[1]表明,高血脂、高血糖、高血压、阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)等多种危险因素都可导致NAFLD的发生。这些危险因素在肝脏中形成异常微环境,经多种信号通路传导至细胞内,诱导细胞自噬水平发生相应改变。在NAFLD中,自噬扮演着多重角色,在肝细胞、Kupffer细胞中激活后,细胞自噬可通过减少脂质积累及肝脏炎症损伤抵抗NAFLD的发展。但是在HSC中,自噬的激活则可诱导HSC的活化从而促进肝纤维化。

1 自噬的基本过程

自噬是细胞内一种保守的降解过程,可介导蛋白质和细胞器在溶酶体中清除。自噬包含多种类型,有微自噬、巨自噬以及分子伴侣介导的自噬,它们与人类正常生理状态的维持及疾病发展密切相关[2],但机制和功能有所不同。哺乳动物的微自噬表现为溶酶体直接内陷分化成自噬管包围并降解周围细胞质,微自噬也参与线粒体、内质网等细胞器的选择性降解[3]。在巨自噬过程中,首先形成双膜囊泡结构的自噬体,自噬体参与吞噬多种细胞内物质,然后由微管运输至溶酶体进行后续降解[1]。巨自噬主要有两种类型,在非选择性自噬中,恰好位于自噬体形成位点的细胞质成分被随机隔离到自噬体中。在选择性自噬中,某些分子、结构和细胞器被称为“自噬受体”的特定蛋白质识别,并被自噬体主动吞噬。自噬对细胞器的选择性降解,主要包括线粒体自噬、脂肪吞噬、溶酶体吞噬、核吞噬和内质网吞噬等[4]。此外,分子伴侣介导的自噬也是一种选择性自噬,主要通过热休克同源71 kD蛋白(HSC70)特异性识别含KFERQ样基序的蛋白质,形成底物-伴侣复合物后与溶酶体相关膜蛋白 2A 型(LAMP2A)结合,最终靶向蛋白质底物进行溶酶体降解[2]。目前的研究中对巨自噬的研究最深入,本文主要探讨微环境诱导的巨自噬(以下简称为自噬)在NAFLD发展中发挥的作用。

随着对巨自噬研究的加深,人们总结了自噬从起始到结束的过程,主要包括自噬启动、成核、自噬体形成、与溶酶体融合并降解内容物。自噬激活的信号通常源自多种应激事件,例如缺氧、饥饿、蛋白质聚集、氧化应激和内质网应激等,通过信号传导激活ULK1复合物触发吞噬泡成核后,募集自噬相关蛋白复合物促进自噬体膜的形成,最终由定位于自噬体膜上的微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)参与结合自噬底物或选择性蛋白质并将其隔离至自噬体内,靶向自噬体与溶酶体融合及内容物降解[1]。在对自噬的研究中发现,高脂、缺氧等微环境可通过调控细胞自噬影响多种疾病的发展[5-6]。在肝脏中,自噬受损可引发肝细胞损伤及脂代谢异常[7],促进NAFLD的发展。

2 NAFLD与肝内微环境异常

与NAFLD相关的主要危险因素包括中心性肥胖、2型糖尿病、血脂异常和高血压等[8],OSA最近也被认定与NAFLD发展和演变相关[9]。这些危险因素构成了促进NAFLD发生发展的肝内复杂微环境。由代谢综合征或高脂饮食(high fat diet,HFD)引发过量的游离脂肪酸及内脏脂肪组织堆积,在肝脏内形成的高脂微环境是影响NAFLD肝损伤进展的最常见因素[10-11]。除血脂异常外,也有研究[12-13]报告了血压与NAFLD之间的密切联系。在门静脉高压的研究中发现,尽管没有肝硬化或明显的纤维化,但在NAFLD中观察到了门静脉高压,即在NAFLD早期门静脉压力或已开始升高。门静脉高压时产生的血流动力学改变是一种非生理性机械压力,可在细胞外形成机械压力微环境触发实质和非实质细胞的机械信号传导,从而导致细胞代谢紊乱、内皮功能障碍和免疫激活信号释放等[14]。

OSA是一种常见疾病,其特征是上呼吸道反复地部分或完全阻塞,引发重复性夜间低氧血症,即慢性间歇性缺氧(chronic intermittent hypoxia,CIH),CIH导致机体组织和器官反复暴露于低氧状态。肝脏作为重要的代谢器官,对血氧需求十分庞大,由CIH导致的重复性低氧血症在肝内形成了间歇性的缺氧微环境,诱发肝脂肪变性及肝损伤[9]。在NAFLD患者中发现,OSA导致的夜间频繁缺氧促进肝损伤及NASH的发生[15];同样,在针对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)与NAFLD的相关性研究中[16]发现,COPD患者中未经治疗的OSA与肝脂肪变性和纤维化具有显著相关性。另外,单一的缺氧环境也被证实通过上调肝细胞PTEN基因缺陷小鼠脂肪生成基因的表达、下调参与脂质代谢的基因并降低胰岛素敏感性来加重并加速NASH进展[17]。

3 高脂微环境与NAFLD肝内自噬

对于自噬参与NAFLD,研究发现自噬可以调节肝脏脂质代谢,通过添加自噬抑制剂3-MA和敲除自噬相关基因5(Atg5)抑制自噬会导致肝内脂肪分解减少、甘油三酯沉积增多[18],特异性激活自噬后可减弱高脂环境在体内外实验中诱导的肝细胞脂质积累[19]。HFD诱导的肥胖小鼠肝脏中Kupffer细胞自噬受损,敲除Kupffer细胞Atg5后肝脏内呈现促炎状态[20]。最新的研究[21]发现,NAFLD患者的疾病进展与肝脏线粒体脂肪酸氧化受损及线粒体自噬受损显著相关。线粒体自噬缺陷被认为是脂肪肝发展的发病机制之一[22],相应地,研究人员也发现了线粒体自噬在NAFLD中的保护作用:Bnip3介导的线粒体自噬维持线粒体功能并有利于脂肪肝疾病中的肝细胞存活[23],通过Mst1的基因敲除从而激活线粒体自噬,可减轻HFD小鼠的肝损伤并减弱棕榈酸对肝细胞凋亡的影响[24]等。自噬在肝细胞及Kupffer细胞中表现为抵抗高脂环境对细胞的损伤及促炎作用,从而阻止NAFLD向纤维化进展。

尽管众多证据表明肝细胞自噬可抵抗NAFLD的发展,但近年来的研究发现,HSC中自噬的发生可能将疾病导向相反的结果。富含脂滴的HSC活化后转分化为肌成纤维细胞并分泌胶原,HSC活化已被证实为促进肝纤维化发生的重要因素[25]。HSC活化的最典型特征之一是细胞质脂滴的丢失[26],研究[27]发现,视黄醇或油酸可诱导已活化的人星状细胞系LX-2细胞逆转为静息状态并抑制原代小鼠HSC的活化、诱导HSC产生更大的脂滴并下调细胞活化标志物,这种逆转可能与自噬抑制相关。有关细胞中自噬参与脂滴分解的现象也早有报道[2,18]。在体外诱导HSC激活的过程中发现细胞内自噬增加,脂滴和自噬标志物LC3-Ⅱ共定位增强,通过自噬抑制剂亦可减弱部分体外HSC的活化[28]。这些证据表明在一些高脂微环境中,自噬被抑制后,HSC的活化可能被抑制或逆转。

4 缺氧微环境与NAFLD肝内自噬

OSA导致的CIH促使NAFLD向纤维化进展,但其分子机制尚不明确。在体外诱导肝细胞缺氧的研究[29]中发现,肝细胞中自噬相关蛋白Atg7在缺氧1 h内减少了80%以上,而在长时间缺氧后,自噬相关基因Beclin-1的减少更加明显,并且自噬受损与缺氧环境中肝细胞的损伤和凋亡密切相关。与急性缺氧中自噬受抑制相反的是,在患有OSA的小鼠体内实验中,OSA诱导的CIH可过度激活肝内自噬,促进肝纤维化发展[30]。类似的,有报告[31]称间歇性缺氧可上调肝细胞自噬,但自噬上调后却发挥着抵抗高脂及氧化损伤的作用:在体外人肝细胞系WRL68进行间歇性缺氧预处理后发现,短期缺氧又复氧后细胞内线粒体自噬水平增加,可抵抗来自H2O2的氧化损伤;在慢性间歇性低压缺氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia,CIHH)实验中,通过低压氧仓模拟高原地区低压低氧环境,将患有由高脂高糖诱导的代谢综合征(metabolic syndrome,MS)大鼠暴露于低压低氧环境后,间歇性缺氧28 d,MS大鼠的肝脂肪变性及炎症反应明显得到改善,这种改善与CIHH通过激活AMPK-mTOR通路上调自噬有关[32]。这些证据表明,急性缺氧损伤肝细胞自噬,而间歇性缺氧可激活肝脏自噬,但间歇性缺氧诱导自噬激活后对于肝损伤的作用却呈现两面性,这种矛盾的结果可能与疾病发展阶段及自噬调节功能的完整性相关。

缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor,HIF-1)是一种对氧敏感的转录激活因子,介导细胞和组织适应缺氧状态,HIF-1α是其主要的功能亚基[33]。研究[33-34]证实缺氧环境及HIF-1在肝脏脂质积累及肝纤维化进展中发挥着重要作用。肝Kupffer细胞中的HIF-1α活化后可通过刺激自噬调控Kupffer细胞在肝脏中的促炎作用[35],尽管在该研究中Kupffer细胞中的HIF-1α是在高脂环境中诱导活化的,但有报告[36]佐证,高脂环境可能会引发肝脏出现缺氧状态。此外,缺氧也可通过上调细胞自噬诱导HSC激活,促进肝纤维化发展[37-38]。Deng等[37]敲低肝星状细胞系LX-2中HIF-1α的基因表达后,自噬分子标志物LC3B-Ⅱ和Beclin-1在缺氧环境中表达的增加受到显著抑制,表明HIF-1α通过自噬调节HSC的激活。种种迹象表明,缺氧环境通过HIF-1α调节肝脏细胞的自噬,从而诱导肝脏炎症及纤维化的发生。HIF-1在缺氧中对肝内自噬调节的研究目前仍处于初步探索阶段,但却是研究缺氧及NAFLD和自噬的关系中毋庸置疑的关键环节。

5 机械压力微环境异常与NAFLD肝内自噬

门静脉高压常被认为是肝硬化的并发症,但最近在一些NAFLD患者中发现,肝脏发生纤维化或肝硬化之前已出现门静脉高压,并且与脂肪变性的程度相关[12-13]。研究人员[39-40]根据门静脉高压促进纤维化的机制提出了正弦压力假说,即窦内压力升高引起肝脏内出现血流动力学改变产生剪切应力,通过生物力学信号传导至窦周细胞来启动纤维化。

一些研究[41-42]表明,挤压力及流体剪切应力等机械压力可在许多细胞中诱导自噬的发生从而调节细胞在压力环境中的生理状态。Yang等[43]利用离心力模拟细胞之间的压力,发现机械压力可以激活肝细胞中肝细胞核因子HNF4α启动子的表达促进肝细胞极化,最近有研究[44]发现,HNF4α可以上调肝细胞中自噬相关基因ULK1的表达从而改善肝脂肪变性,阻碍NAFLD的发展,但肝细胞中机械压力是否通过HNF4α调节细胞自噬及其具体的分子机制仍需进一步的探索。HSC位于Disse间隙中,受到机械压力的作用,机械压力可影响HSC的迁移[45],并诱导HSC中TGFβ的产生[46],但是自噬是否参与机械压力对HSC的作用却鲜有报道。细胞外基质(ECM)的网状结构具有机械塑性和黏弹性,细胞之间可利用这种结构传递机械信号互相影响。在器官的纤维化扩展中,ECM的状态随之发生变化,其硬化后的基质通过黏着斑传递机械信号,导致排列的细胞骨架结构改变和细胞弹性增加[13]。有研究表明,ECM的一些成分如Ⅵ型胶原等也参与自噬的调节[47],并且这种自噬调节可能与调节机械信号的YAP/TAZ信号通路相关[48],不过也有报告称自噬可反向调节YAP分子的降解从而抵抗HCC的发展[49],但这种分子机制在NAFLD进展中的具体作用仍不得而知。

尽管目前仍没有可以直观反映肝内细胞所承受压力变化的实验装置,但现有证据表明,细胞所受到的各种机械压力可能通过生物信号传导的方式诱导自噬,在调节细胞大小和调节各种细胞反应方面发挥着重要作用。

6 小结与展望

NAFLD的发展演变是由肝细胞、Kupffer细胞、HSC之间以及与微环境之间复杂的相互作用引起的。现有的证据表明,在肝细胞及肝Kupffer细胞中上调的自噬可以抵抗来自高脂、缺氧、门静脉高压等刺激诱导的肝损伤和炎症发生,但在HSC中自噬又通过激活HSC产生胶原促进纤维化的发生(图1)。在一些实验动物模型中,自噬的药理学激活已被证实可预防NAFLD,因此,开发针对肝脏的自噬调节剂将成为未来治疗肝病的重要切入点,但由于自噬在肝脏的不同细胞中对疾病进展的影响有所不同,如何在不影响其他细胞的情况下选择性地靶向特定细胞类型的自噬过程仍然是一个重要问题。此外,自噬受损或过度自噬均可促进NAFLD的发展,不仅涉及脂质自噬、线粒体自噬及其他细胞内容物自噬等,还涉及多种信号通路。揭示肝内微环境对肝内细胞(肝细胞、HSC、Kupffer细胞、内皮细胞等)自噬调节的分子机制,将是重要的研究方向,对于阐明NAFLD的发生机制及开发新药具有重要的意义和价值。

图1 微环境通过自噬调节NAFLD进展示意图Figure 1 Schematic illustration of the progression of NAFLD regulated by autophagy in the microenvironment

利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明:寇萱萱负责拟定写作思路并撰写文章;张华、邓婧鑫参与相关文献的收集与整理;张建刚审校并修改论文。