布鲁氏菌在中枢神经系统内致病机制的研究进展*

赵云慧 赵世刚,2 马晓玮 赵若楠 王 媛

1 内蒙古医科大学,内蒙古呼和浩特市 010000; 2 内蒙古医科大学附属医院

布氏杆菌病是一种常见的人畜共患病,尤其是在发展中国家,最常见的感染方式为摄入被污染的食物或乳制品[1]。人布氏杆菌病可以影响多个系统,产生广泛的临床症状和体征[2]。神经型布氏杆菌病是其较为严重的并发症,是由布鲁氏菌属侵入中枢神经系统(CNS)引起的神经退行性炎症性疾病。研究指出,位于血液微循环和脑实质之间的血脑屏障(BBB)对于保护CNS免受细菌病毒入侵至关重要[3-4]。构成BBB的脑微血管内皮细胞是循环血液与CNS之间的动态接口,相邻内皮细胞之间通过紧密连接相连,严重限制了细胞旁通透性[5],对大多数细菌病毒病原体有良好的防御作用。以下将介绍布鲁氏菌穿过BBB在CNS内的致病机制。

1 布鲁氏菌进入中枢神经系统——特洛伊木马机制

BBB位于循环血液和CNS之间,由血管内皮细胞、周细胞和细胞外基质共同构成[4]。BBB是一种坚固且具有高度调节能力的物理屏障,对外源性神经毒性成分起到良好的阻挡作用。由于BBB的低渗透性,只有小的亲脂分子和气态分子能够进入脑实质,严格限制血液中其他分子和离子的通过[4]。BBB 对维持CNS稳态以及神经元功能正常提供了良好的保障。

布鲁氏菌是革兰氏阴性球杆菌,大小为 0.6～1.5μm。受BBB的限制,布鲁氏菌并不能直接进入CNS,通常认为布鲁氏菌参与CNS感染是通过血源性传播发生的,然而对于布鲁氏菌离开血液进入CNS的确切机制仍不明确。因为布鲁氏菌可以在细胞内存活,特别是在巨噬细胞内,早在2004年Drevets DA 等人提出了受感染的巨噬细胞BBB易位可能是布鲁氏菌侵入CNS的机制,但未得到证实。近来,通过体外建模逐渐证实上述观点,布鲁氏菌在BMEC中黏附、侵袭和复制,但细菌本身并不能穿过BMEC单层,而是在受感染单核细胞内穿过BMEC单层,这就是所谓的特洛伊木马机制,就像木马携带隐藏的敌人进入特洛伊城一样,巨噬细胞携带布鲁氏菌通过BBB侵入CNS。

1.1 中性粒细胞在布鲁氏菌穿过血脑屏障中的作用 近来研究指出,被布鲁氏菌感染的中性粒细胞可能作为特洛伊木马机制的载体,对于细菌在宿主内的分散、复制和建立慢性感染至关重要[6]。大多数细菌感染会诱导中性粒细胞的活化,增强其杀菌功能,并促进这些白细胞长时间存活。与这些细菌不同的是,布鲁氏菌作为一种隐形病原体,它逃避先天免疫,几乎不激活中性粒细胞,并抵抗这些吞噬细胞的杀伤作用[7]。这与在布鲁氏菌感染期间靶器官内布鲁氏菌感染的中性粒细胞数量较少,以及部分患者出现外周血中性粒细胞减少相一致[8]。细菌侵入宿主后,中性粒细胞是第一个遇到并吞噬布鲁氏菌的免疫细胞,被吞噬的布鲁氏菌可以在中性粒细胞中存活很长一段时间并诱导中性粒细胞过早死亡[8-9]。一旦布鲁氏菌进入中性粒细胞,布鲁氏菌的脂多糖就会移动到质膜或细胞内囊泡中的细胞表面分化抗原14(CD14)脂蛋白结构域,然后,布鲁氏菌脂多糖的非内毒素脂质A会部分募集还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH),促进活性氧的受控生成,触发中性粒细胞的死亡机制。这些垂死的中性粒细胞仍在进行氧化代谢,释放趋化因子配体8(CXCL8),并将磷脂酰丝氨酸(PS)转运到膜外表面,并以时间依赖方式在膜外表面表达PS信号[6,10],之后,巨噬细胞发现受感染的中性粒细胞并特异性检测这些细胞上的PS信号,并且将这些受布鲁氏菌感染的中性粒细胞以选择性非炎性方式去除[9]。 这时,受感染的中性粒细胞则作为特洛伊木马机制的载体,将布鲁氏菌运输至巨噬细胞中,为布鲁氏菌在细胞内运输并在吞噬细胞中复制打开了一个新的窗口,这也将延迟适应性免疫系统的激活,使病原菌建立长期感染[11]。该观点也在动物实验中得以证实[7]。Mora-Cartín R等人的研究指出,无论是否产生适应性免疫,中性粒细胞的缺失都有利于布鲁氏菌在小鼠中的有效清除[11]。证实了中性粒细胞在造成布鲁氏菌慢性感染中的作用。

1.2 血小板在布鲁氏菌穿过血脑屏障中的作用 血小板广泛被熟知的作用为止血介质并负责维持血管完整性。然而最近的研究表明,血小板在调节先天性和适应性免疫反应中也具有重要作用。Aldana Trotta等人的研究指出布鲁氏菌能够直接与血小板相互作用,这种相互作用触发了血小板活化[12],活化血小板与未活化的血小板相比,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)分泌和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表面表达均显著增加,结果表明,活化的血小板能够改变内皮细胞的趋化(MCP-1)和黏附(ICAM-1)特性,从而增加吸引单核细胞和中性粒细胞的能力。布鲁氏菌刺激血小板分泌因子诱导BMEC活化,导致ICAM-1和细胞表面分化抗原40(CD40)上调,增加白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和趋化因子配体-2(CCL-2)的分泌,并促进中性粒细胞和单核细胞穿过活化的BMEC单层,从而导致感染细胞从外周循环通过BBB进入CNS引起神经胶质细胞感染[13]。总而言之,受布鲁氏菌刺激的血小板会诱导内皮细胞活化,促进中性粒细胞和单核细胞穿过BBB,这也可能导致神经布鲁氏菌病的炎症病理学。

2 布鲁氏菌诱导的神经胶质细胞增生和小胶质细胞活化在中枢神经系统中的致病机制

在特洛伊木马机制中发挥重要作用的单核细胞不仅是布鲁氏菌穿过BBB的桥梁还是神经胶质细胞感染的来源[14]。星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化是神经性布氏杆菌病标志性特征,在国内很少对神经型布氏杆菌病患者进行大脑活检,报告病例也屈指可数,Seidel G等人报告1例神经型布氏杆菌病的脑活检结果,表明小胶质细胞活化在这种罕见疾病中发挥免疫致病作用,Sohn AH报告的两例脑活检患者均表现出星形胶质细胞增生。Guzmán-Verri C等人在动物实验中也得到了相同的结论。那么在明确布鲁氏菌导致星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化后,它们在中枢神经系统如何致病,以下将分别阐述。

2.1 布鲁氏菌诱导的神经胶质细胞增生对神经血管单元的影响 神经血管单元(NVU)早在21世纪初就被确立,强调血管细胞、神经胶质细胞、神经元之间的相互作用。脑疾病以神经为中心的观点已经逐渐过时,广泛被接受的是维持大脑正常功能不仅取决于神经元,还取决于NVU中神经元、神经胶质细胞、血管细胞以及脑血管系统内的基底层基质之间的相互作用[15]。其中,神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞三者相互作用,维持NVU表型永久化。作为NVU重要组成部分的星形胶质细胞,已经被证实,可以与脑内皮细胞相互作用调节血脑屏障的功能,研究表明星形胶质细胞通过激活内皮基质金属蛋白酶9促进β-淀粉样蛋白诱导的血脑屏障损伤[16]。同样,星形胶质细胞和内皮细胞的存在对神经元的生长和成熟起到一定支持作用[17]。其次,神经胶质细胞与血管细胞的结合可减少内皮细胞的凋亡稳定了微脉管系统,从长远来看会诱导BBB特征,从而保留了其表型[18]。布鲁氏菌导致的神经胶质细胞增生和小胶质细胞增生打破了神经胶质细胞、内皮细胞、神经元三者的平衡,使其相互作用受到影响,最终会导致NVU破坏。

2.2 布鲁氏菌激活的神经胶质细胞对血脑屏障的影响 脑脊液中白细胞增多是神经性布氏杆菌病的特征之一。曹敬荣等通过对12例神经型布氏杆菌病患者进行脑脊液检测,发现12例患者脑脊液中白细胞数均不同程度升高[19]。细胞增多表明BBB的完整性在神经布鲁氏菌病中发生了改变,与布鲁氏菌引起的其他 CNS 生理学改变一样,BBB完整性的改变是由星形胶质细胞和小胶质细胞介导的。

研究表明,Toll样受体(TLR)通过不同的先天免疫细胞识别布鲁氏菌[20-23]。同样,布鲁氏菌DNA触发的信号通路还涉及黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)和干扰素基因刺激因子(STING)[24]。含吡啶环的蛋白质3(NLRP3)通过检测布鲁氏菌诱导的线粒体活性氧而被激活[25]。布鲁氏菌在TLR2、NLRP3和AIM2被神经胶质细胞识别。布鲁氏菌激活的星形胶质细胞和小胶质细胞会诱导炎性细胞因子白介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、趋化因子CCL2和趋化因子配体1(CXCL1)的分泌。这些促炎因子介导会破坏BBB的完整性,并从外周血液中吸引免疫细胞。更为重要的是IL-1β在CNS内的作用:调节BBB通透性、激活常驻神经胶质细胞和白细胞募集等。在布鲁氏菌感染CNS的情况下,布鲁氏菌感染的神经胶质细胞分泌的IL-1β能够激活BMEC。BMEC的激活导致IL-6、IL-8和CCL2的分泌,以及ICAM1表达的上调,从而增强中性粒细胞和单核细胞穿过BMEC单层的能力。

神经胶质细胞分泌IL-1β和内皮细胞激活需要半胱天冬酶1(CASP-1)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC),这表明炎症小体也参与了IL-1β的产生和随后布鲁氏菌对BBB的激活[26]。炎症小体是CNS中先天免疫系统的关键信号分子。在体外研究中发现,布鲁氏菌感染的神经胶质细胞对BMEC的激活与内皮细胞促进中性粒细胞和单核细胞迁移的能力增加相关。这种现象依赖于受感染的神经胶质细胞在AIM2和NLRP3炎症小体激活后分泌的IL-1β[26]。在动物实验中,缺乏AIM2或NLRP3的小鼠,布鲁氏菌在小鼠大脑中诱导的血管周围中性粒细胞浸润减少,表明炎症因子将决定吞噬细胞向脑实质的迁移。在布鲁氏菌感染期间,布鲁氏菌与神经胶质细胞相互作用引发的炎症反应会激活BMEC从而增加免疫细胞从外周渗入。这也可以解释在神经型布鲁氏菌病患者脑脊液中观察到的白细胞增多的现象。

2.3 布鲁氏菌激活的小胶质细胞诱导的神经元损伤 尽管布鲁氏菌病临床表现千变万化,但炎症是其标志性特征,神经性布鲁氏菌病可在疾病的任何阶段发展,并有广泛多样的表现,包括脑炎、脑膜脑炎、脊髓炎、外周和颅神经病变等。不可逆的CNS损伤导致上述严重后果,而这种CNS损伤可能归结于神经元丢失。那么,在布鲁氏菌感染CNS期间,哪些细胞会损伤神经元,如何损伤,以下将简要阐述。

被称为“中枢神经系统守护者”的小胶质细胞是大脑的常驻巨噬细胞,是脑内一种特有的免疫细胞,在对抗感染和维持组织稳态方面发挥重要作用[27]。但其对于神经元损伤方面亦有不可忽视的影响。在更多的生理条件下,小胶质细胞可以通过释放扩散因子诱导发育中的神经元凋亡[28],小胶质细胞也可能通过释放神经生长因子[29]或TNF-α等杀伤剂在神经元死亡中发挥作用[30]。当然,活化小胶质细胞还可以分泌多种具有神经保护作用的介质,然而这种介质大多数是促炎和有神经毒性的。综上所述,小胶质细胞在布鲁氏菌感染中枢神经系统中的作用更倾向于导致神经元损伤和死亡。

研究表明布鲁氏菌不能直接感染神经元或者诱导其死亡,导致神经元死亡的真正原因是被布鲁氏菌激活的小胶质细胞[21]。被激活的小胶质细胞释放炎症介质一氧化氮(NO),当然这种炎症介质并不足以导致神经元死亡,但是NO可以诱导神经元暴露PS,在 PS 暴露后,PS 结合蛋白乳脂球表皮生长因子8及其小胶质细胞受体(玻连蛋白受体)介导小胶质细胞对神经元的吞噬作用。那么,这种吞噬作用是导致神经元死亡的元凶还是发生在神经元死亡之后?Rodríguez AM的研究证实阻断神经元的小胶质细胞吞噬作用可防止神经元丢失,而不会增加凋亡神经元的数量,这表明吞噬作用是其死亡的原因,而不是其后果[21]。小胶质细胞吞噬作用诱导的神经元死亡在 TLR 被激活但促炎细胞因子水平相对较低的情况下占主导地位,导致吞噬作用的神经元损伤不太严重,因为损伤足以暴露PS信号而不触发细胞凋亡或坏死[31]。这也解释了布鲁氏菌引起的慢性感染,其炎症反应较轻的特点。感染组织中持续存在的活细菌引起组织损伤,并刺激机体长期处于低水平炎症环境中。受感染的小胶质细胞会导致中枢神经系统中神经元缓慢丢失,导致神经型布氏杆菌病中观察到的神经功能缺陷。

3 小结与展望

近年来,布氏杆菌病的基本特点逐渐被阐明,但对其严重并发症--神经型布氏杆菌病阐述相对较少,尤其是布鲁氏菌在中枢神经系统的致病机制尚未在分子和细胞水平进行研究。近来研究指出,布鲁氏菌对先天免疫的直接激活是感染后损害神经系统的病理反应基础。当布鲁氏菌侵入中枢神经系统内的单核细胞时,受感染的星形胶质细胞和小胶质细胞会产生一个可以导致胶质细胞结构破坏、脑内皮细胞激活和神经元死亡的炎症微环境,外周浸润的免疫细胞会放大这种反应,形成一种恶性循环,导致神经型布氏杆菌病的不断加重与迁延不愈。

神经型布氏杆菌病的发病机制仍不完全清楚,对我们了解疾病过程造成一定困难。发病机制贯穿疾病的全过程,是制定正确的预防、控制和治疗策略必不可少的理论基础。本文旨在根据一些新近的研究进展,对理解神经型布氏杆菌病致病机制做一些有限的探索。研究神经型布氏杆菌病的致病过程不仅需要关注布鲁氏菌对神经元以及神经胶质细胞的影响,还需要阐述感染过程中的布鲁氏菌与血脑屏障的相互作用,这样才有可能对其致病机制有一个全面、正确的了解,以期为提高神经型布氏杆菌病的预防、控制、治疗水平做必要的理论基础方面探索。