熊果苷对糖尿病心肌病小鼠心肌损伤的抑制作用及其机制

郭雪琳，马锋锋，周海佳

空军军医大学第二附属医院心血管内科，西安 710038

流行病学数据显示，预计到2025年我国糖尿病患者数量将上升至3亿，其中近50%的患者可能发生心脏功能障碍［1］。糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病最严重的并发症之一，特征是在没有冠状动脉粥样硬化、高血压或其他心血管疾病情况下出现的病理性心脏重塑［2］。DCM进展涉及多种机制，包括心肌氧化应激、炎症和心肌细胞缺失，并且氧化应激损伤和炎症反应也加速了心肌细胞的缺失［3-4］。心肌细胞是心脏最主要的细胞，心肌细胞大量缺失不仅可以引起心肌纤维化，同时也会诱发心脏功能衰竭。研究显示，从天然植物熊果叶中萃取出的对苯二酚化合物熊果苷（AR）具有较强的抗氧化应激和抗炎特性，在多种心血管疾病中展现了积极的治疗作用［5-9］。2022年8月—2023年3月，本研究通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）联合高糖高脂饮食法建立DCM小鼠模型，并观察AR对DCM小鼠心肌损伤的影响及其可能的作用机制，为DCM的心肌保护治疗提供新的思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：清洁级雄性C57BL/6小鼠60只，6～8周龄，体质量20～25 g，购自空军军医大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（军）2007-007号。主要药物及试剂：AR、STZ均购自美国Sigma公司；沉默信息调节因子1（SIRT1）特异性抑制剂EX527购自美国Sigma公司，SIRT1抗体和SIRT1活性检测试剂盒均购自美国Abcam公司；胶原蛋白Collagen1、Collagen3引物均由上海生工生物工程科技有限公司设计合成；氧化应激相关因子超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）均购自南京建成生物工程研究所，活性氧（ROS）检测试剂盒、超氧化物阴离子荧光探针（DHE）购自美国Invitrogen公司，氧化应激标志物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）引物均由上海生工生物工程科技有限公司设计合成；细胞焦亡相关因子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）和凋亡相关斑点样蛋白（ASC）抗体均购自美国Abcam公司，炎症相关因子白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）引物均由上海生工生物工程科技有限公司设计合成；焦亡信号关键蛋白白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素18（IL-18）抗体均购自美国Abcam公司，裂解的半胱氨酸蛋白酶1（cleaved Caspase-1）抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 模型建立与分组处理 将60只雄性C57BL/6小鼠随机分为Con组、DCM组、DCM+AR组、DCM+AR+EX527组，每组15只。Con组正常饮食饮水，其余三组均建立DCM小鼠模型［10］：给予小鼠高糖高脂饮食1个月后，连续3 d腹腔注射STZ 60 mg/kg；2周后，通过尾静脉检测空腹血糖≥16.7 mmol/L即可认为糖尿病模型初步建立成功，后续仍给予高糖高脂饮食12周，经心脏超声检查证实成功建立DCM模型。DCM+AR组和DCM+AR+EX527组建模成功后给予AR 50 mg/（kg·d）灌胃12周，同时DCM+AR+EX527组建模后即给予EX527 20 mg/kg腹腔注射，1周/次，共注射11次。

1.3 心脏功能测定 采用VisualSonics 770超声心动图仪。取分组处理后的各组小鼠，取仰卧位，异氟烷麻醉，保持心率400～500次/分。采用超声心动图仪30 MHz换能器测量左心室收缩功能，计算左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。

1.4 心肌组织病理情况观察 各组小鼠心脏功能测定完成后腹腔注射巴比妥类药物进行处死，经左侧肋间开胸摘取心脏，在预冷的PBS中漂洗3次，取部分心脏标本直接液氮保存；另一部分心脏标本在10%多聚甲醛溶液中浸泡48 h，石蜡包埋，制备厚度为5 µm的切片。①Masson染色：取各组部分心脏组织石蜡切片，脱蜡后再水化，采用Masson三色法染色，胶原纤维被染成蓝色、肌纤维被染成红色，显微镜拍照后用Image J软件评估心肌组织纤维化程度。②天狼星红染色：取部分心脏组织石蜡切片，脱蜡后再水化，采用天狼星红染色，胶原被染成红色、肌纤维被染成黄色，显微镜拍照后用Image J软件评估心肌组织胶原沉积情况。

1.5 心肌组织NF-κB表达 采用免疫荧光染色。取部分心脏组织石蜡切片，脱蜡后再水化；切片抗原修复后滴加10%山羊血清，常温封闭1 h；加入抗NF-κB一抗（1∶ 200），4 ℃条件下孵育过夜；加入生物素标记的二抗，室温条件下孵育1 h；将DAPI核染色液滴加到组织切片上，避光水浴，37 ℃条件下孵育15 min；采用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜拍照，观察NF-κB红色荧光强度。

1.6 SIRT1去乙酰化活性检测 采用ELISA法。取各组部分液氮中快速冷冻的心脏组织，根据试剂盒说明书，将SIRT1检测缓冲液、氟底物肽、NAD和显影液的混合物在室温下孵育1 h，使用SpectraMax M5分光光度仪测定吸光度值，计算SIRT1去乙酰化活性。

1.7 心肌组织ROS、SOD及MDA检测 取各组部分液氮中快速冷冻的心脏组织，切成厚度为5 µm的冰冻切片；滴加DHE染液，37 ℃避光孵育15 min，采用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜拍照，Image J软件分析二氢乙锭荧光相对强度，以此表示ROS表达。取各组部分液氮中快速冷冻的心脏组织，制备心脏组织匀浆，按照试剂盒说明书滴加反应液，使用SpectraMax M5分光光度仪进行分光光度分析，以此表示MDA、SOD表达。

1.8 心肌组织IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。取各组部分液氮中快速冷冻的心脏组织，加入TRIzol试剂提取总RNA，测定其纯度及浓度合格，使用SuperScript第一链合成系统将RNA逆转录为cDNA。IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4及内参GAPDH引物序列见表1。采用CFX96实时PCR系统c1000热循环仪进行反应，2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

表1 相关基因及内参GAPDH引物序列

1.9 心肌组织SIRT1、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白检测 采用Westen blotting法。取各组部分液氮中快速冷冻的心脏组织，提取总蛋白。将蛋白按每孔30 µg上样量在8%～15%SDS-PAGE凝胶中电泳分离，并转移到聚偏氟乙烯膜上。加入SIRT1、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18及内参GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶ 1 000、1∶ 1 000、1∶ 1 000、1∶ 500、1∶ 1 000、1∶ 1 000、1∶ 5 000），4 ℃孵育过夜；加入山羊抗兔或羊抗鼠偶联二抗，室温孵育2 h。使用ECL Plus化学发光系统进行显影，Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法 采用GraphPad Prism 9.0统计软件。计量资料采用K-S正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，两重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠心脏功能比较 与Con组比较，DCM+AR组、DCM组、DCM+AR+EX527组小鼠LVEF、LVFS均降低，以DCM组、DCM+AR+EX527组降低更明显（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠LVEF、LVFS比较（）

表2 各组小鼠LVEF、LVFS比较（）

注：与Con组比较，*P＜0.05；与DCM+AR组比较，#P＜0.05。

组别Con组DCM+AR组DCM组DCM+AR+EX527组n5 5 5 5 LVEF（%）68.56 ± 4.98 48.34 ± 4.00*33.59 ± 2.94*#34.25 ± 3.85*#LVFS（%）32.87 ± 3.22 23.54 ± 2.78*15.62 ± 1.47*#15.40 ± 1.58*#

2.2 各组小鼠心肌组织病理情况比较 Con组心肌组织无明显蓝色胶原纤维及红色胶原着色，即无显著纤维化及胶原沉积；与Con组相比，DCM+AR组、DCM组、DCM+AR+EX527组小鼠均存在心肌组织纤维化程度增加、胶原沉积增多，以DCM组、DCM+AR+EX527组变化更明显。见OSID码图1。

2.3 各组小鼠心肌组织NF-κB表达及SIRT1去乙酰化活性比较 与Con组比较，DCM+AR组、DCM组、DCM+AR+EX527组小鼠心肌组织NF-κB表达升高、SIRT1去乙酰化活性降低，以DCM组、DCM+AR+EX527组变化更明显（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠心肌组织NF-κB表达及SIRT1去乙酰化活性比较（）

表3 各组小鼠心肌组织NF-κB表达及SIRT1去乙酰化活性比较（）

注：与Con组比较，*P＜0.05；与DCM+AR组比较，#P＜0.05。

组别Con组DCM+AR组DCM组DCM+AR+EX527组SIRT1去乙酰化活性0.96 ± 0.12 0.73 ± 0.07*0.37 ± 0.12*#0.36 ± 0.12*#n5 5 5 5 NF-κB 1.00 ± 0.13 2.12 ± 0.37*3.79 ± 0.58*#4.06 ± 0.49*#

2.4 各组小鼠心肌组织SOD、MDA、ROS表达比较 与Con组比较，DCM+AR组、DCM组、DCM+AR+EX527组小鼠心肌组织SOD表达均降低，MDA、ROS表达均升高，以DCM组、DCM+AR+EX527组变化更明显（P均＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠心肌组织SOD、MDA、ROS表达比较（）

表4 各组小鼠心肌组织SOD、MDA、ROS表达比较（）

注：与Con组比较，*P＜0.05；与DCM+AR组比较，#P＜0.05。

组别Con组DCM+AR组DCM组DCM+AR+EX527组ROS 1.07 ± 0.10 1.69 ± 0.23*3.48 ± 0.20*#3.53 ± 0.22*#n5 5 5 5 SOD（U/mg）257.52 ± 29.80 213.51 ± 17.19*144.35 ± 26.29*#150.86 ± 13.60*#MDA（nmol/mg）6.71 ± 0.17 8.38 ± 0.63*11.35 ± 0.92*#11.47 ± 0.98*#

2.5 各组小鼠心肌组织IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA表达比较 与Con组比较，DCM+AR组、DCM组、DCM+AR+EX527组小鼠心肌组织IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA表达均升高，以DCM组、DCM+AR+EX527组升高更明显（P均＜0.05）。见表5。

表5 各组小鼠心肌组织IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA相对表达量比较（）

表5 各组小鼠心肌组织IL-6、TNF-α、Collagen1、Collagen3、NOX2、NOX4 mRNA相对表达量比较（）

注：与Con组比较，*P＜0.05；与DCM+AR组比较，#P＜0.05；

组别Con组DCM+AR组DCM组DCM+AR+EX527组NOX4 1.02 ± 0.13 1.73 ± 0.24*3.13 ± 0.37*#3.06 ± 0.42*#n5 5 5 5 IL-6 1.03 ± 0.14 2.71 ± 0.58*6.04 ± 0.85*#5.36 ± 0.69*#TNF-α 0.93 ± 0.14 3.10 ± 0.60*4.61 ± 0.70*#4.59 ± 0.78*#Collagen1 1.08 ± 0.15 1.87 ± 0.26*3.47 ± 0.43*#3.37 ± 0.38*#Collagen3 1.01 ± 0.11 2.14 ± 0.40*4.56 ± 0.47*#4.46 ± 0.45*#NOX2 1.05 ± 0.13 2.32 ± 0.32*4.25 ± 0.42*#4.18 ± 0.46*#

2.6 各组小鼠心肌组织NLRP3、ASC、SIRT1、IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1蛋白表达比较 与Con组和DCM+AR组比较，DCM组、DCM+AR+EX527组小鼠心肌组织NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1蛋白相对表达量均升高，SIRT1蛋白相对表达量均降低（P均＜0.05）。见表6及OSID码图2。

表6 各组小鼠心肌组织NLRP3、ASC、SIRT1及IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1蛋白相对表达量比较（）

表6 各组小鼠心肌组织NLRP3、ASC、SIRT1及IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1蛋白相对表达量比较（）

注：与Con组比较，*P＜0.05；与DCM+AR组比较，#P＜0.05。

组别Con组DCM+AR组DCM组DCM+AR+EX527组cleaved Caspase-1 1.02 ± 0.13 1.34 ± 0.15 2.04 ± 0.23*#1.89 ± 0.21*#n5 5 5 5 NLRP3 1.02 ± 0.17 1.33 ± 0.20 2.18 ± 0.22*#2.07 ± 0.24*#ASC 0.96 ± 0.15 1.31 ± 0.24 3.20 ± 0.38*#3.05 ± 0.44*#SIRT1 1.02 ± 0.11 0.89 ± 0.10 0.43 ± 0.08*#0.45 ± 0.12*#IL-1β 1.06 ± 0.13 1.38 ± 0.19 2.39 ± 0.23*#2.22 ± 0.22*#IL-18 1.03 ± 0.14 1.40 ± 0.19 2.61 ± 0.21*#2.51 ± 0.33*#

3 讨论

糖尿病患者预后不良主要与机体长期糖脂代谢紊乱引起的各种并发症有关，导致如心脏、肾脏、大脑等多器官的损害和功能障碍［11］。糖尿病心肌损伤是糖尿病患者最致命的并发症之一，DCM的心功能障碍通常归因于心肌的病理结构改变，其特征是细胞外胶原沉积和基质重塑。过多胶原形成和心肌纤维化进展会加重心肌硬化，进而影响心脏收缩功能［2，12］。AR是近年来发现的一种具有多重药理活性的酚类化合物，在多种心血管疾病中展现了积极的治疗作用［6-9］。研究报道，AR可通过调控心肌细胞凋亡，改善异丙肾上腺素所致心肌纤维化和心脏功能损伤［13］。本研究通过构建DCM小鼠模型并对其给予持续AR灌胃处理，结果显示与DCM组相比，DCM+AR组小鼠心肌组织纤维化程度降低，胶原沉积减少，Collagen1和Collagen3 mRNA表达下调，LVEF、LVFS升高；提示AR可以改善DCM小鼠的心脏收缩功能，减轻心肌损伤，减少胶原沉积和心肌纤维化，证实AR可作为一种潜在的治疗DCM的心肌保护药物。

氧化应激是由ROS过量产生引发的，是DCM发生的主要机制之一［14］。由于糖脂代谢失调，脂质过氧化产物和晚期糖基化终产物的积累，破坏了ROS形成和清除之间的平衡，最终引起心肌细胞内氧化应激损伤［15］。因此，抑制ROS的产生对治疗DCM至关重要。在糖尿病动物模型中，通过减轻炎症反应同样能够达到明显的心肌保护作用［16］。NF-κB是诱导心肌炎症的核心分子，不仅能诱导TNF-α和IL-6等促炎细胞因子表达，同时能进一步促进单核细胞、淋巴细胞和巨噬细胞在心肌的募集和浸润，再次放大炎症反应［17-18］。本研究结果显示，与DCM组相比，DCM+AR组小鼠心肌组织ROS和MDA表达下降，SOD表达上升，氧化应激标志物NOX2和NOX4 mRNA表达下调，NF-κB表达降低，炎症因子IL-6、TNF-α mRNA表达下降；这表明AR可通过减轻小鼠心肌组织氧化应激损伤和炎症反应而发挥抗DCM心肌损伤的作用。

近年来研究发现，细胞焦亡参与多种心血管疾病的发生发展［19］。细胞焦亡是细胞坏死和凋亡之外的一种炎症性程序性细胞死亡方式，主要由炎症小体激活Caspase-1介导的相关信号通路引发［20］。研究表明，糖尿病心肌损伤时存在细胞焦亡，并可能是该病理条件下心肌细胞缺失的主要原因［21-22］。此外，心肌氧化应激和炎症反应也是引起心肌细胞发生焦亡的关键始动因素。ROS是重要的炎症激活信号，可诱导角质形成细胞、心肌细胞、肠上皮细胞和星形胶质细胞中NLRP3炎症小体依赖性焦亡［23］；而NF-κB表达升高同样能增加NLRP3炎症小体的组装和Caspase-1的自切或激活，进而介导IL-1β的活化，导致细胞发生焦亡［24］。本研究结果显示，与DCM组相比，DCM+AR组小鼠心肌组织炎症小体形成关键蛋白NLRP3、ASC表达及焦亡信号关键蛋白IL-1β、IL-18、cleaved Caspase-1表达均下降；这表明AR可进一步抑制心肌细胞发生焦亡反应，从而减少心肌细胞缺失，最终减轻DCM心肌损伤。

为了探究AR发挥上述保护作用的潜在分子机制，我们检索到SIRT1对炎症小体具有抑制作用，而作为细胞焦亡最重要的启动因子，炎症小体的减少必定会影响细胞焦亡的发生［25-26］。SIRT1是依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶，不仅可以去乙酰化组蛋白，还可以去乙酰化很多重要的转录因子和调节蛋白，这种效应导致细胞内蛋白质活性的改变，从而调控多种生物学过程。在心肌缺血再灌注损伤中，SIRT1上调能够显著抑制NLRP3、Caspase-1、IL-18等炎症小体相关蛋白和促焦亡蛋白的表达［27］。此外，miR-138-5p可通过调控SIRT1而抑制细胞焦亡，从而减缓心肌梗死的进展［28］。然而SIRT1是否同样可以介导AR在DCM模型中抑制细胞焦亡的作用仍待进一步验证。本研究结果显示，与Con组相比，DCM组小鼠心肌组织SIRT1蛋白表达及活性均下降，心肌细胞焦亡加重；而给予AR处理后，DCM+AR组小鼠心肌组织SIRT1蛋白表达及活性均增加，心肌细胞焦亡减轻；进一步给予SIRT1特异性抑制剂EX527发现，阻断SIRT1信号不仅明显逆转了AR对心肌细胞焦亡的抑制作用，同时也逆转了AR的上述抗糖尿病心肌损伤效果。以上结果表明，SIRT1信号是AR减轻DCM心肌损伤作用中的关键分子靶点。

综上所述，AR可通过减轻心肌组织氧化应激损伤和炎症反应，进而抑制炎症小体形成和心肌细胞焦亡，最终减轻DCM小鼠的心肌损伤，其机制可能与激活SIRT1信号通路有关，为临床防治DCM心肌损伤提供了一个新的思路。