黄芪总皂苷对肺腺癌细胞增殖、迁移、凋亡能力及HIF-1α/VEGF信号通路蛋白表达的影响

陈静，田伟平，韦小白

上海市静安区中心医院肿瘤科，上海 200040

肺癌是全球肿瘤相关死亡的主要原因，由于其临床症状不明显，75%的患者确诊时已处于中晚期，丧失了手术治疗最佳时机［1］。在过去的30年里，由于肺癌的高复发率及高侵袭性，导致患者的5年生存率仍只有18%［2］。随着近年来中医药研发工程的兴起，临床研究者逐渐将重点放在中药方面。研究表明，中药可减轻化学药物的毒性，增强放化疗敏感性，减少肿瘤复发和转移［3］。黄芪总皂苷具有抗癌、抗氧化、免疫调节等作用，而含有黄芪药物的一些中药复方在改善肿瘤患者的生活质量、减轻化疗药物的血液学毒性及肝功能损害等方面均具有重要作用［4］。炎症是肿瘤发生的原因之一，巨噬细胞极化是进入炎症微环境的切入点，黄芪总皂苷可通过阻断肺癌相关巨噬细胞的M2极化，从而抑制肺癌细胞生长、侵袭、迁移和血管生成能力［5］。除了诱导免疫细胞极化，黄芪总皂苷是否还可以通过其他途径发挥作用，目前仍不是十分清楚。2021年10月—2022年10月，本研究观察了黄芪总皂苷对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，并探究其相关分子机制是否与缺氧诱导因子1α（HIF-1α）/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路有关，为黄芪总皂苷在肺癌治疗中的应用提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人肺腺癌细胞株A549购自上海酶研生物科技有限公司。药物：黄芪总皂苷购自上海一飞生物科技有限公司，纯度99.1%。主要试剂：RPMI1640培养基和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司，标准胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，表皮生长因子受体（EGFR）、VEGF抗体均购自英国Abcam公司，HIF-1α抗体购自美国CST公司，辣根过氧酶标记的二抗购自北京中杉金桥科技有限公司。

1.2 细胞分组处理 将肺腺癌A549细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，待细胞长满培养瓶80%时用胰蛋白酶消化、计数、传代。将肺腺癌A549细胞分为黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组，分别加入浓度为200、100、50 µmol/L的黄芪总皂苷和等体积的二甲基亚砜（DMSO）。

1.3 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。取对数生长期的肺腺癌A549细胞，以1×105/mL接种于96孔板，设3个复孔，参照“1.2”进行分组处理。各组培养24 h，每孔加入CCK-8溶液10 µL，继续培养2 h。使用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（A对照孔-A实验）/A对照孔×100%。

1.4 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。使用马克笔在6孔板的背面均匀作一平行直线，每孔5条。每孔加入各组分组处理后培养24 h的细胞悬液2 mL（包含约5×105个细胞），待细胞铺满孔底后，用枪头作一垂直于马克笔横线的划痕，PBS漂洗后加入细胞培养基，显微镜下拍照，记为0 h划痕宽度。将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中，继续培养24 h，显微镜下拍照，记为24 h划痕宽度。计算各组细胞迁移距离，细胞迁移距离=0 h划痕宽度-24 h划痕宽度。

1.5 细胞凋亡能力观察 采用流式细胞术。取各组分组处理后培养24 h的细胞，用不含EDTA的0.25%胰酶消化，1 200 r/min离心5 min，去上清，加PBS重悬。用PBS将细胞冲洗2次，1 200 r/min离心5 min，去上清。上流式细胞仪检测细胞凋亡率，严格参照AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。

1.6 细胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白检测 采用Western blotting法。取各组分组处理后培养96 h的细胞，PBS冲洗后加入细胞裂解液，冰浴20 min，12 000 r /min离心15 min，取上清液，采用Bradford法测定蛋白含量。100 ℃变性10 min，每孔加等量蛋白样品进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜上，5%牛奶室温封闭1 h。分别加入HIF-1α、VEGF、EGFR及内参GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000及1∶10 000），4 ℃孵育过夜。TBST漂洗5 min×3次，加入二抗（稀释比例为1∶1 000），室温孵育1 h，TBST洗涤10 min×3次。ECL室温反应5 min后曝光，Syngene凝胶成像仪扫描。采用GeneSnap光密度软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计量资料采用K-S正态性检验，呈正态分布时以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布时以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率、细胞迁移距离及细胞凋亡率比较 黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率依次降低，细胞迁移距离依次升高，组间两两比较P均＜0.05。见表1及OSID码图1。

图1 各组细胞VEGF、HIF-1α、EGFR蛋白表达条带图（Westen blotting法）

表1 各组细胞增殖抑制率、细胞迁移距离及细胞凋亡率比较（）

表1 各组细胞增殖抑制率、细胞迁移距离及细胞凋亡率比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，#P＜0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，△P＜0.05。

组别黄芪总皂苷高剂量组黄芪总皂苷中剂量组黄芪总皂苷低剂量组对照组细胞凋亡率（%）39.62 ± 2.23*#△28.12 ± 0.74*#11.05 ± 0.12*4.02 ± 0.13细胞增殖抑制率（%）68.74 ± 3.18*#△49.16 ± 4.43*#26.32 ± 5.94*9.34 ± 5.38细胞迁移距离（µm）0.298 ± 0.015*#△0.461 ± 0.027*#0.618 ± 0.034*0.773 ± 0.042

2.2 各组细胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相对表达量比较 黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组细胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相对表达量均依次升高，组间两两比较P均＜0.05。见表2及图1。

表2 各组细胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相对表达量比较（）

表2 各组细胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，#P＜0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，△P＜0.05。

EGFR 0.48 ± 0.42*#△0.64 ± 0.59*#0.72 ± 0.31*0.83 ± 0.23组别黄芪总皂苷高剂量组黄芪总皂苷中剂量组黄芪总皂苷低剂量组对照组HIF-1α 0.19 ± 0.85*#△0.27 ± 0.08*#0.37 ± 0.18*0.46 ± 0.34 VEGF 0.23 ± 0.19*#△0.39 ± 0.34*#0.51 ± 0.24*0.61 ± 0.12

3 讨论

黄芪总皂苷是从中草药黄芪中纯化而来，其性质甘甜温和，参与肺和脾的经络调节，具有调理脾胃、补血益气、防治风寒等功效，对增强人体免疫功能具有显著疗效。同时，黄芪总皂苷也可通过调节各种免疫信号传导通路蛋白和因子，参与抗炎和保护神经细胞活性等过程［6-7］。研究显示，黄芪总皂苷可通过调节mTOR信号通路的传导，抑制相关编码基因表达，进而降低肿瘤细胞VEGF蛋白表达，抑制肿瘤组织新生血管生成和肿瘤远处转移［8］。本研究结果显示，黄芪总皂苷对肺腺癌A549细胞增殖具有明显抑制作用，随着黄芪总皂苷药物浓度的升高，其增殖抑制作用和促凋亡能力增强；经过不同浓度黄芪总皂苷处理过的肺癌细胞迁移能力降低，随着黄芪总皂苷药物浓度的升高，其迁移能力逐渐降低；这提示黄芪总皂苷可降低肺腺癌细胞的增殖、迁移能力，并诱导其凋亡，且浓度越高效果越明显。这与既往研究证实黄芪总皂苷能够抑制人乳腺癌细胞增殖和侵袭能力［9］的结论一致。

转移是肿瘤相关死亡的主要原因，而新生血管生成是肿瘤转移的潜在机制之一。血管是介导远端转移的重要结构，参与加速肿瘤生长、维持肿瘤微环境、提供生长和侵袭信号、促进肿瘤转移等多种过程，并可引起肿瘤相关的全身性疾病［10］。HIF-1α是细胞缺氧时形成的缺氧诱导因子，在肿瘤血管新生过程中处于重要地位，当细胞外环境出现缺氧或细胞代谢率过高导致相对缺氧时，可以激活组织及细胞大量表达HIF-1α［11］。HIF-1α的活性水平与肿瘤发生、血管生成和转移相关。同时，HIF-1α位于多种致癌和抑癌途径的交汇点，包括PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路，而这些信号通路是分子信号网络的核心，控制着许多细胞的生长、增殖、分化和生存，而肿瘤组织常高表达HIF-1α［12-13］。VEGF是一类结构和功能相关的蛋白分子，其靶基因VEGF-A在转录水平上主要受HIF-1α的调控，可通过促进血管内皮细胞增殖而促进肿瘤血管生成［14］。EGFR信号蛋白作为HIF-1α/VEGF信号通路的上游调控因子，参与了肿瘤血管生成。研究表明，在EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中，可以以缺氧独立的方式上调HIF-1α，从而诱导VEGF表达，而当EGFR信号通路被抑制时VEGF下调，这提示EGFR的激活可能驱动VEGF表达［15］。HIF-1α/VEGF是肿瘤血管生成的重要信号通路，EGFR信号蛋白参与了该信号通路的传导及调节。本研究结果显示，黄芪总皂苷干预后肺腺癌A549细胞HIF-1α、VEGF和EGFR蛋白表达均降低，提示黄芪总皂苷对肺腺癌A549细胞发挥抗肿瘤作用可能是通过使HIF-1α/VEGF信号通路失活来实现的。

综上所述，黄芪总皂苷可降低肺腺癌细胞的增殖、迁移能力，并诱导其凋亡，其机制可能与抑制HIF-1α/VEGF信号通路有关。至于黄芪总皂苷调控肿瘤细胞生物学行为的过程中是否有其他作用机制尚未可知，需进一步实验证实。