北疆地区马链球菌分离鉴定及耐药性和毒力基因分析

2023-09-08 10:44孙丹岚买占海佟盼盼陈见兴布阿依夏木吾斯曼
中国动物传染病学报 2023年3期
关键词:马场亚种毒力

孙丹岚,买占海,佟盼盼,陈见兴,罗 洁,张 磊,布阿依夏木·吾斯曼,况 玲

(新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052)

链球菌种类繁多,有的属于动物正常菌群,而有的是致病菌,如化脓性链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌等,可引起动物的肺炎、败血症、脑膜炎、乳腺炎等,给畜牧养殖业和公共卫生造成严重威胁。肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,SP)发现于1881年,是各种感染如社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎、脓肿、败血症等的主要致病菌之一,尤其对于婴幼儿和老年人,其中肺炎、败血症和脑膜炎致死率较高[1]。SP有超过90种血清型,且目前的疫苗不能完全覆盖[2-3]。SP携带多种毒力基因,其导致各种感染疾病的具体机制有待明确,毒力基因在此过程中可能具有重要作用,这种作用可能体现在毒力基因的有无和表达水平两个方面[4-6]。

马链球菌(Streptococcusequi,S.equi)属于兰氏分群的C群β溶血链球菌,包括兽疫亚种(Streptococcusequisubspecieszooepidemicus,SEZ)、马亚种(Streptococcusequisubspeciesequi,SEE)和类马亚种(Streptococcusequisubspecies ruminatorum,SER)三个不同的亚种[7]。马腺疫(Strangles)是一种散发性或地方流行性的马属动物接触性传染病,该病以发热、上呼吸道黏膜炎症、颌下淋巴结肿胀化脓为典型特征[8]。带菌马已被认为是维持病原体长期存在和暴发感染的重要因素[9]。其发病率可达100%,死亡率达10%[10]。病菌随病马喷鼻、咳嗽及脓肿破溃排出体外,经消化道、上呼吸道黏膜、扁桃体或受损皮肤感染健康马匹[11]。患病幼驹也可因吮乳,将细菌传染给母马,引起马乳房炎,甚至引发败血症[12]。

马链球菌的致病性和耐药性研究在国内研究较少,常见的毒力基因有fneB[13],临床常用青霉素、四环素和磺胺类药物等进行治疗[14],同时,耐药链球菌的出现也导致基层马场遭受很大经济损失,临床用药亟需新的思路。本实验通过对马场采集样品进行细菌分离培养,利用药敏实验和PCR检测,测定并分析马链球菌及其他链球菌的耐药性和毒力基因,从而为基层马场临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种来源 24株链球菌分离自2019年9月至2020年4月昌吉及伊犁马场的132份健康及患病马匹马鼻拭子样本。

1.2 主要试剂 THB培养基购自青岛高科技工业医海博生物技术有限公司;革兰氏染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司;药敏纸片:青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢他啶、头孢噻肟、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、强力霉素、恩诺沙星、磺胺甲基异恶唑购自杭州滨和生物公司。

1.3 细菌分离培养与纯化 无菌状态下吸取采集的马鼻拭子样品1 mL加入到3 mL THB液体培养基中,在37℃、160 rpm的摇床中震荡培养12~24 h,进行增菌培养。用接种环沾取菌液在THB固体培养基上进行平板划线接种,倒置于37℃的恒温培养箱中过夜培养,观察菌落形态,挑取针尖大小的菌落继续培养。一般需要提纯3次或3次以上,直到培养基菌落单一、稳定为止。

1.4 菌株的形态观察 显微镜观察挑取纯化的单菌落进行革兰氏染色,在油镜(100×)下观察其形态特征。

1.5 菌株的PCR鉴定及测序 以提取的分离菌株基因组DNA为模板,用16S RNA通用引物,进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)为:上、下游引物各2 μL,DNA模板2 μL,2×TaqPCR Green Mix 25 μL,ddH2O补至50 μL。用凝胶成像分析系统观察结果。扩增条件为:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,49℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35个循环。目标条带大小为197 bp。将鉴定有目标条带的PCR产物测序。

1.6 药敏实验 采用标准K-B纸片扩散法,检测分离菌株对青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢他啶、头孢噻肟、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、强力霉素、恩诺沙星、磺胺甲基异恶唑12种抗生素的敏感性。

1.7 菌株耐药基因及毒力基因的检测 通过PCR和琼脂糖凝胶电泳分析从链球菌中提取的DNA,确定是否存在耐药基因或毒力基因。根据相关文献报道和现有研究,选取流行率较高的基因[15-17]。耐药基因分别为:耐β-内酰胺类(blaTEM、blaCTX-M)、耐四环素类(tetA)、耐磺胺类(SulI)、耐喹诺酮类(qnrA、aac(6'))。以上6个耐药基因PCR扩增引物序列和反应运行参数见表2。毒力基因分别为:ply、pspA、nanA、psaA、lytA、seM、fneB。以上7个毒力基因PCR扩增引物序列和反应运行参数见表2。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系(20 μL)为:2×TaqPCR Green Mix 10 μL,上、下游引物1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O补至20 μL。用凝胶成像分析系统观察结果,胶回收产物于-20℃保存备用。

表1 PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

表2 链球菌对常见菌药敏实验结果Table 2 Results of drug sensitivity test of Streptococcus to common bacteria

2 结果

2.1 培养结果 链球菌在THB固体培养基平板上培养,直径0.1~1.0 mm,灰白色,表面光滑,边缘整齐的小菌落。马链球菌在绵羊血平板上长出针尖大小白色菌落,有溶血环(图1)。

图1 马链球菌马亚种在绵羊血培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of Equi on sheep blood

2.2 镜检结果 菌体呈蓝紫色,为革兰氏阳性菌,直径0.6~1.0 μm。菌体似矛头状排列单个或多个排列成链状,无芽孢、无菌毛(图2)。

图2 链球菌革兰氏染色镜检结果(100×)Fig.2 Microscopic examination of Streptococcus by Gram staining (100×)

2.3 PCR结果 根据目的条带显示,对采集样品进行PCR鉴定,共得到24株链球菌。图3为其中两株菌的结果。

图3 链球菌16S PCR扩增结果Fig.3 Amplification results of Streptococcus 16S PCR

2.4 测序结果 对在197 bp目的条带下的11株菌进行测序,通过测序确定9株马链球菌马亚种(Y1、Y2、Y3、D1、D2、D3、L1、L2、L3),两株肺炎链球菌(0-1,35-61)。

2.5 药敏结果 24株链球菌对12种抗菌药物的耐药情况由表2和表3可见,本实验所分离的肺炎链球菌对强力霉素、青霉素的耐药率很高,对四环素、头孢他啶的耐药率也较高,对磺胺甲基异恶唑、恩诺沙星、氨苄西林、氯霉素都较为敏感。所分离的马链球菌对磺胺甲基异恶唑耐药性较高,对氨苄西林、头孢噻肟、四环素的耐药性也超过半数,对氯霉素、头孢氨苄、头孢他啶、庆大霉素、强力霉素的耐药性较低,对红霉素、恩诺沙星敏感。

表3 马链球菌对常见菌药敏实验结果Table 3 Drug sensitivity test results of Streptococcus equi to common bacteria

2.6 耐药基因检测结果 对鉴定出的24株链球菌分离株进行6种耐药基因检测,检测结果如表4所示,除blaCTX-M、tetA、SulI和aac(6')基因外,其余2种耐药基因均有检测到。其中blaTEM基因在17个菌株中均被检出,对各菌株耐药基因组合分布进行统计,含有2个以上耐药基因的菌株有2株(8.3%),其余7株菌未检测出任何耐药基因(表4)。部分阳性结果见图4、图5。

图5 qnrA基因检测结果Fig.5 qnrA gene detection results

表4 不同菌株的耐药基因检测情况Table 4 Detection of drug resistance genes

2.7 毒力基因检测结果 对鉴定出的24株链球菌分离株进行7种毒力基因检测,检测结果可知,除pspA、nanA、psaA和seM基因外,其余3种毒力基因均有检测到。其中lytA和fneB基因分别在8个和9个菌株中均被检出,对各菌株毒力基因组合分布进行统计,含有3个以上毒力基因的菌株有3株(12.5%),其余10株菌未携带毒力基因(表5)。部分阳性结果见图6~8。

图6 ply基因检测结果Fig.6 ply gene detection results

图7 lytA基因检测结果Fig.7 lytA gene detection results

图8 fneB基因检测结果Fig.8 fneB gene detection results

表5 不同菌株的毒力基因检测情况Table 5 Detection of virulence genes

3 讨论

马亚种马链球菌是马腺疫的主要病原,在马和驴的脓肿淋巴结中也曾分离出,马链球菌的致病性耐药性研究在国内研究较少,本研究分离出的链球菌中,有9株马链球菌,其中D1、D2、D3、L1、L2、L3 6株马链球菌来自昌吉某马场,Y1、Y2、Y3 3株菌来自伊犁某马场,Neamat-Allah等[17]认为马腺疫全年发病,但在春季发病率较高,Radostits等[18]研究得出马腺疫多发生于寒冷季节的结论,本研究的样品为秋季和春季末采集。

本实验分离出的肺炎链球菌和马链球菌马亚种,样品均采样自昌吉某马场。分离出的马链球菌马亚种中有1株对庆大霉素、氯霉素耐药;有5株对四环素耐药;有5株对头孢噻肟耐药;有1株对头孢他啶耐药;有4株对氨苄西林耐药。

根据耐药基因的结果,24株菌株中,有17株携带β-内酰胺类耐药基因blaTEM,说明在链球菌中blaTEM基因有较高携带几率,其中1株链球菌(HW5-1-2)和1株马链球菌(Y1)同时携带了喹诺酮类耐药基因qnrA,为多重耐药菌株。经过耐药表型和耐药基因数据的对照可知,耐药表型与耐药基因并不完全相符,如马链球菌和其他链球菌对四环素类药物的耐药率均较高,马链球菌5株,其他链球菌10株,但因为只检测了一种四环素类耐药基因(tetA),并没有检测出相关耐药基因的存在,可能是菌株DNA中还有没发现的其他耐药基因存在,本次实验没有检测到。根据毒力基因的结果来看,有5株链球菌携带lytA基因,9株马链球菌均携带fneB基因,值得关注的是,有3株马链球菌同时携带3个毒力基因,分别为ply基因,lytA基因及FneB基因。根据耐药性结果和毒力基因结果综合分析,马链球菌(Y1),同时携带两种耐药基因(blaTEM基因和qnrA基因)及一种毒力基因(fneB基因)。在临床用药中应尽量避免在对马链球菌引起的疾病中用β-内酰胺类药物进行治疗。

通过本次实验可知,北疆地区马源链球菌对常见药物有较高的耐药率,提示该地区耐药情况比较严重;应重视由耐药菌株引起的链球菌病在马场中传播的严峻形势。综上所述,应做到抗生素轮换使用并谨慎选择,避免因滥用抗生素出现大量耐药菌。

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