麻杏咳喘颗粒的水提工艺优化Δ

梁董茜 ，王晶晶 ，王 欣 ，柴天川 ，李春花 ，4，5#（.河北中医药大学药学院，石家庄 05000；.保定市第一中医院脑病科，河北 保定 07000；.河北省中医院制剂室，石家庄 0500；4.河北省中药组方制剂技术创新中心，石家庄 05009；5.河北省高校中药开发与产业化应用技术研发中心，石家庄 05009）

麻杏咳喘方是河北省中医院治疗“风温肺热病”“哮病”等疾病的经验方，临床使用近20年，疗效确切。该方由蜜麻黄、炒苦杏仁、蝉蜕、地龙、陈皮、防风、矮地茶、桑白皮、清半夏、厚朴、穿山龙、僵蚕、甘草组成，具有疏风宣肺、止咳平喘之效，主要用于治疗风邪犯肺、肺气失宣所致的咳嗽、咽痒、干咳无痰或少痰等。方中蜜麻黄宣肺平喘，炒苦杏仁润肺止咳，二者共为君药；蝉蜕疏散风热，地龙清热息风平喘，二者均为臣药；陈皮、厚朴理气止咳化痰，防风祛风解表，矮地茶化痰止咳，清半夏、桑白皮清肺化痰，穿山龙止咳平喘，僵蚕祛痰止咳，同为佐药；甘草调和诸药为使药。该方为传统中药汤剂，需临用前进行煎煮，质量不易控制，且煎液体积较大、服用不便、不利贮存，故本研究团队拟将其开发为颗粒剂，以便临床使用。

Box-Behnken响应面法是对实验条件多个因素及水平进行分析的优选方法，具有实验次数少、结果准确度高等特点[1]；层次分析（analytic hierarchy process，AHP）-熵权法是对各指标进行赋权的方法，兼具AHP 法、熵权法的优点，使所得结果更加真实可靠[2]。本研究以浸泡时间、加水量、总提取时间为考察因素，以蜜麻黄的有效成分盐酸麻黄碱[3]、矮地茶的有效成分岩白菜素[4]、防风的有效成分升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷[5]、陈皮的有效成分柚皮苷和橙皮苷[6—7]的含量以及出膏率为考察指标，采用AHP-熵权法对上述7 种指标进行赋权，通过Box-Behnken响应面法筛选出麻杏咳喘颗粒的最佳水提工艺，以期为麻杏咳喘颗粒的开发及应用提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

LC-20A型高效液相色谱仪购自日本Shimadzu公司（包括LC-20AT 泵、SIL-20A 自动进样器、SPD-M20A 紫外检测器、CTO-20A柱温箱）；SQP型十万分之一电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TG328B 型万分之一分析天平购自上海精密科学仪器有限公司；TGL-16B 型离心机购自上海安亭科学仪器厂；RE-52 型旋转薄膜蒸发器购自上海亚荣生化仪器厂；SAS67120型超纯水系统购自美国Millipore 公司；BGG-9240A 型鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 药品与试剂

蜜麻黄（产地内蒙古，批号211201）、炒苦杏仁（产地河北，批号220501）、蝉蜕（产地河北，批号220502）、陈皮（产地浙江，批号21103001）、防风（产地内蒙古，批号220501）、桑白皮（产地四川，批号220201）、清半夏（产地河北，批号D211201）、厚朴（产地四川，批号220501）、穿山龙（产地河北，批号220301）、僵蚕（产地四川，批号220501）、甘草（产地内蒙古，批号220301）均购于河北药兴药业有限公司，地龙（产地广东，批号21103001）、矮地茶（产地河北，批号18032601）购于国药乐仁堂河北药业有限公司，以上饮片经检查均符合2020年版《中国药典》（一部）项下相关规定。盐酸麻黄碱（批号171241-201809，纯度100.0%）、岩白菜素（批号111532-202005，纯度94.4%）、升麻素苷（批号111522-202214，纯度95.7%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-202212，纯度97.8%）、柚皮苷（批号110722-202116，纯度93.5%）、橙皮苷（批号110721-202220，纯度97.2%）对照品均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 指标成分的含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Venusil MP C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～12 min，10%A→16%A；12～44 min，16%A→24%A；44～55 min，24%A→35%A；55～60 min，35%A→90%A）；柱温为30 ℃；检测波长分别为210 nm（盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、柚皮苷）、283 nm（5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷）；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL。

2.1.2 供试品溶液和阴性样品溶液的制备

按处方比例称取各味饮片共59.5 g，加10倍量（mL/g）水浸泡30 min，煎煮2 h；过滤煎液，离心，取上清液减压浓缩至119 mL，得浓缩液。取2 mL 浓缩液置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，摇匀，取上清液过0.22 µm 微孔滤膜，即得供试品溶液。同法制得分别缺蜜麻黄、矮地茶、防风、陈皮的阴性样品溶液。

2.1.3 混合对照品溶液的制备

精密称定盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解后定容，制得上述成分质量浓度分别为1.870 0、0.726 0、0.590 0、1.020 0、0.232 0、2.140 0 mg/mL的单一对照品母液。吸取各对照品母液1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容，即得混合对照品溶液。

2.1.4 方法学考察

（1）专属性考察：取上述供试品溶液、各阴性样品溶液、混合对照品溶液、甲醇溶液（空白）适量，按上述色谱条件进样，记录色谱图。结果显示，甲醇溶液无干扰，混合对照品溶液和供试品溶液中各指标成分的分离度均大于1.5，专属性良好。结果见图1。

图1 专属性考察结果的色谱图

（2）线性关系考察：取“2.1.3”项下混合对照品溶液，加甲醇逐级稀释，得各成分不同质量浓度的对照品溶液，按上述色谱条件进样分析，以质量浓度为横坐标（x）、以峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。结果见表1。

表1 各指标成分的线性关系考察结果

（3）精密度试验：取“2.1.3”项下混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6 次，记录峰面积，得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷峰面积的RSD 分别为2.06%、2.42%、2.70%、1.56%、1.95%、0.69%（n＝6），表明仪器精密度良好。

（4）重复性试验：按“2.1.2”项下制备方法，平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件进样，记录峰面积，根据外标法计算各成分含量，得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量的RSD 分别为1.73%、2.28%、1.82%、1.56%、0.62%、2.61%（n＝6），表明该方法重复性良好。

（5）稳定性试验：取同一供试品溶液，于室温放置0、4、8、12、16、24 h 时，分别按上述色谱条件进样，记录峰面积，得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷峰面积的RSD 分别为1.04%、2.01%、2.76%、1.89%、1.42%、1.47%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定。

（6）加样回收率试验：取已知各成分含量的浓缩液1 mL，共6 份，精密加入与各成分含量成1∶1（m/m）比例的盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷对照品各适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，并计算加样回收率。结果显示，盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷的平均加样回收率分别为101.54%、100.73%、101.80%、97.47%、98.86%、101.67%，RSD 分别为2.46%、2.38%、1.62%、1.52%、1.25%、2.39%（n＝6），表明该方法准确度良好。

2.2 出膏率的测定

精密量取浓缩液适量，置于干燥、恒重的蒸发皿中，采用烘箱于105 ℃下干燥至恒重；取出，放入干燥器中冷却30 min，称重，采用减重法计算出膏率[8]。

2.3 综合评分相关指标的权重确定

2.3.1 AHP法主观赋权

采用AHP 法对设定的各项指标进行主观赋权[2]，根据麻杏咳喘颗粒处方中各味药的君臣佐使关系及用量，对各指标进行层次划分，顺序为盐酸麻黄碱＝岩白菜素＞橙皮苷＝柚皮苷＞升麻素苷＝5-O-甲基维斯阿米醇苷＞出膏率，由此构建优先判断矩阵，见表2。计算得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷、出膏率的主观权重系数W1分别为0.250 8、0.250 8、0.084 6、0.084 6、0.145 5、0.145 5、0.038 1，一致性比率为0.009 1（＜0.10），表明所计算的指标权重系数可靠、有效。

表2 各指标的优先判断矩阵

2.3.2 熵权法客观赋权

采用熵权法对设定的各项指标进行客观赋权[2]，运用极值法无量纲化处理所得数据，以熵值法确定各指标权重系数（W2）。原始数据矩阵为X＝（Xij）mn，其中Xij为正指标，使用公式对已知数据进行处理，得标准化数据，所得数据均向右平移0.000 01 个单位以消除0 的影响。采用公式Hj=计算各指标熵值（0≤Hj≤1，Pij=为概率矩阵）。采用公式计算各指标客观权重系数。

2.3.3 综合权重系数确定及综合评分计算

将AHP法、熵权法确定的各指标权重系数W1、W2相结合，计算综合权重系数（W综合）：W综合=[2]。将各指标的W综合代入公式，计算综合评分，综合评分＝100×（盐酸麻黄碱含量/盐酸麻黄碱含量最大值×盐酸麻黄碱的W综合+岩白菜素含量/岩白菜素含量最大值×岩白菜素的W综合+升麻素苷含量/升麻素苷含量最大值×升麻素苷的W综合+5-O-甲基维斯阿米醇苷含量/5-O-甲基维斯阿米醇苷含量最大值×5-O-甲基维斯阿米醇苷的W综合+柚皮苷含量/柚皮苷含量最大值×柚皮苷的W综合+橙皮苷含量/橙皮苷含量最大值×橙皮苷的W综合+出膏率/出膏率最大值×出膏率的W综合）。

2.4 麻杏咳喘颗粒水提工艺参数的单因素实验

本研究考察了浸泡时间、加水量、总提取时间、提取次数4个因素对提取效果的影响[8]。按“2.3”项下方法计算盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷和出膏率的综合权重，发现当考察因素为浸泡时间时，各指标的W综合分别为0.205 4、0.233 5、0.073 0、0.101 4、0.208 0、0.146 4、0.032 2；考察因素为加水量时，各指标的W综合分别为0.235 5、0.258 6、0.079 5、0.094 8、0.118 7、0.179 0、0.033 9；考察因素为总提取时间时，各指标的W综合分别为0.198 7、0.200 6、0.077 1、0.096 9、0.240 1、0.149 5、0.037 1；考察因素为提取次数时，各指标的W综合分别为0.246 1、0.269 0、0.070 7、0.086 0、0.140 1、0.145 5、0.042 7。以7项指标的综合评分作为指标，在固定其他3个条件不变的前提下，分别对浸泡时间（0、30、60、90 min）、加水量（6、7、8、9、10 倍）、总提取时间（90、150、210、270、330 min）、提取次数（1、2、3 次）进行单因素考察，各平行3次。结果见图2。

图2 麻杏咳喘颗粒提取工艺参数的单因素考察结果

由图2可知，图2A的曲线呈上升-平稳趋势，图2B、图2C的曲线均呈上升-下降趋势；由于提取次数为不连续因素，故不作为Box-Behnken 响应面实验的考察因素。另外，图2D 中曲线呈上升趋势，提取次数为2、3 次时的综合评分分别为88.95、90.82 分，数值差距小，且差异无统计学意义（P＝0.450），故固定提取次数为2 次。因此，根据实验数据及生产实际，选取浸泡时间30 min、加水量8倍、总提取时间150 min作为Box-Behnken响应面实验优化的中心点。

2.5 Box-Behnken 响应面法优化麻杏咳喘颗粒的水提工艺

2.5.1 Box-Behnken响应面实验设计

参照单因素实验结果，应用Design-Expert V8.0.6.1软件进行Box-Behnken 响应面实验设计[1]，固定提取次数为2 次，以综合评分为响应值，考察浸泡时间（A）、加水量（B）、总提取时间（C）对水提工艺的影响。具体因素与水平见表3。

表3 因素与水平表

2.5.2 Box-Behnken响应面实验方案及结果

按“2.3.2”项下方法计算得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的熵值分别为0.889 1、0.911 9、0.921 9、0.908 0、0.913 8、0.909 6、0.917 0；客观权重系数W2分别为0.176 4、0.140 2、0.124 3、0.146 3、0.137 1、0.143 8、0.132 0。AHP法所得主观权重系数W1不变，以AHP-熵权法综合赋权计算得盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的W综合分别为0.298 5、0.237 2、0.071 0、0.083 6、0.134 6、0.141 2、0.033 9。按“2.3.3”项下公式计算不同Box-Behnken响应面实验方案所得综合评分，结果见表4。

表4 Box-Behnken响应面实验方案及结果

2.5.3 Box-Behnken响应面实验结果分析

采用Design-Expert V8.0.6.1软件多元拟合分析17组实验所得综合评分，得多元二次回归方程：综合评分＝92.99+1.77A+3.23B+3.59C+1.87AB+0.4AC－1.09BC－5.58A2－4.93B2－3.17C2。方差分析结果见表5。

表5 Box-Behnken响应面实验的方差分析结果

由表5可知，拟合模型的P值为0.004 3（＜0.01），表明模型显著；失拟项的P值为0.133 1（＞0.05），表明失拟不显著，提示其他未明原因对实验结果影响较小，模型可靠。R2、Radj2分别为0.919 8、0.816 8，表明81.68%的响应值变化可被模型解释；r为0.919 8，表明所选变量可造成91.98%的响应值变化。变异系数为2.99%（＜10%），表明实验重复性、模型拟合度均良好。由此可知，该模型可用于分析并预测麻杏咳喘颗粒的水提工艺。一次项A为不显著影响，B、C为显著影响，3个因素对综合评分的影响程度依次为C＞B＞A，即总提取时间＞加水量＞浸泡时间；交互项的影响均不显著；二次项A2、B2、C2均为显著影响。

经软件处理数据后，得到反映因素间交互强弱的等高线图和响应面图，具体见图3。等高线图中闭合曲线形状越趋向于正圆形时交互作用越弱，闭合曲线越趋向于椭圆形时交互作用越强；响应面图中曲面越陡、坡度越大，则因素间交互作用对综合评分的影响越大。由图3A可知，闭合曲线为更接近于圆形的椭圆形，曲面坡度变化较小，表明综合评分变化不明显，AB交互作用不显著；由图3B 可知，椭圆形闭合曲线更接近于圆形，曲面坡度变化小，表明综合评分变化不明显，AC交互作用不显著；由图3C 可知，闭合曲线接近于圆形，曲面坡度变化较小，表明综合评分变化不明显，BC交互作用不显著。将响应面图中的曲面坡度变化进行比较后发现，图3A 中B曲面比A曲面坡度变化大，图3B 中C曲面较陡峭，图3C中C曲面较B曲面更陡峭，由此可知，3个因素对综合评分的影响程度与方差分析结果相同。

图3 各因素对麻杏咳喘颗粒水提工艺综合评分的影响

进一步利用软件预测麻杏咳喘颗粒的最佳水提工艺参数为：浸泡时间36.93 min，加水量8.31倍，总提取时间181.65 min。结合实际生产操作的可行性，将参数调整为：浸泡时间40 min，加水量8倍，总提取时间180 min（即第1次提取120 min，第2次提取60 min）。

2.5.4 工艺验证

按比例称取处方饮片119 g，平行3 份，按上述最佳预测工艺进行验证实验，得综合评分为94.82分（RSD＝0.96%，n＝3），与预测值94.64分差异较小，表明预测、优化后所得工艺均稳定可行。

3 讨论

笔者在前期预实验中通过高效液相色谱法检测出了苦杏仁苷、甘草苷，但两者分离度较低，经更换流动相、调整流动相比例后，仍未能提高其分离度，故本研究不将其列为指标成分。

笔者参考2020 年版《中国药典》对各单味药材进行含量测定时，考察了以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相时对实验结果的影响，结果发现，当流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液时，色谱峰分离度良好、基线平稳。采用DAD 检测器在190～800 nm 波长范围内对供试品溶液进行全波长扫描后发现，盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、柚皮苷在210 nm 波长处的紫外吸收较强，5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷在283 nm波长处的紫外吸收较强，故本研究选择双波长对供试品进行测定。

本研究选用主、客观赋权相结合的AHP-熵权法确定各指标权重，相比于仅用AHP法或熵权法赋权更加科学合理。AHP法由研究者赋权各指标，能考虑到组方药材间关系、用量、疗效，但忽视了实际实验数据，主观性强[9]；熵权法根据实际得到的数据赋权各指标，消除了主观影响，却忽略了各指标间的主次轻重[10]。因此，AHP-熵权法能兼具二者的优点，使结果更合理可靠。

本研究以AHP-熵权法赋权计算盐酸麻黄碱、岩白菜素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的综合评分，采用Box-Behnken 响应面法对麻杏咳喘颗粒的水提工艺进行优化，方法科学可靠，筛选出麻杏咳喘颗粒的最佳水提工艺为浸泡时间40 min，加水量8倍，总提取时间180 min。经验证，该方法可行，可为麻杏咳喘颗粒的进一步开发提供参考。