先进生物技术在纤维素燃料乙醇中的应用及展望

李秀娟，王明慧，乔 杰，金明杰，黄 和

(1.南京师范大学食品与制药工程学院，江苏 南京 210097；2.南京理工大学环境与生物工程学院，江苏 南京 210094)

燃料乙醇是一种由生物质转化而来的可再生能源，广泛用作汽油的替代品，其CO2排放相对较低，与传统的化石燃料相比，具有更好的环境效益[1]。根据美国可再生燃料协会数据显示，2015年以来，全球燃料乙醇产量一直维持小幅增长的状态，截止2020年，在新冠肺炎疫情的影响下，全球燃料乙醇产量降至985亿L[2]。美国和巴西是世界上最早大规模发展燃料乙醇产业且产量最大的国家[3]，主要目的是实施能源多元化和自给化，以减轻油价波动对经济发展的冲击。巴西作为一个高度依赖进口石油的国家，在发展燃料乙醇之前曾面临巨大的能源安全风险。20世纪70年代爆发的两次石油危机对巴西经济造成了严重的冲击。因此，巴西利用其甘蔗产业的成本优势，积极发展生物燃料乙醇产业并取得了突飞猛进的发展。根据巴西能源部的数据，2021年巴西的乙醇产量达到了320亿L，其中大部分用于替代汽油[4]。巴西政府实施了乙醇掺混政策，要求汽油中含有一定比例的燃料乙醇，以促进可再生能源的使用。美国是全球最大的燃料乙醇生产国和消费国。根据美国能源信息管理局(EIA)的报告，美国2021年乙醇产量同比增长11.5%，约4 500万t[2]。燃料乙醇的使用在美国得到了政府的支持，政府通过生物质负担减免税收和可再生燃料标准等政策来促进乙醇产业的发展。欧洲在燃料乙醇的发展方面也取得了一定的进展。根据欧洲生物燃料协会(ePURE)的数据，欧洲国家在2019年生产了约62亿L的燃料乙醇。欧盟成员国制定了可再生能源指令，要求到2030年将可再生能源在交通领域的使用比例提高到14%[5]，这将促进欧洲对燃料乙醇需求的增长。

我国生物燃料乙醇产业的发展始于“十五”初期，当时主要是为了解决陈化粮的再利用问题，经国务院批准同意，正式启动了生物燃料乙醇试点[6]。经过20多年的发展，我国已经成为全世界第三大燃料乙醇生产国和消费国，为国民经济发展和社会可持续发展做出了产业贡献[7]，据数据显示，2020年中国乙醇产量986.45万t，较2016年增长271.45万t，增幅37.97%。2021年1月《2021年能源监管工作要点》提到“积极支持生物液体燃料发展，扎实做好乙醇汽油推广监管”，这推动了未来燃料乙醇行业的发展将从产能扩张转向技术升级[7]。

1 新时代下纤维素燃料乙醇发展的可行性与潜力

当今，纤维素燃料乙醇作为一种可再生能源能够实现我国能源领域多方面的转型和改进，推动其持续发展具有重大市场潜力和应用前景。

1.1 有助于环境保护与减排

新时代下，环境保护成为全球关注的重要议题之一。与传统的化石燃料相比，燃料乙醇作为可再生能源，可减少温室气体的排放。有研究表明，添加乙醇的燃料汽油可减少汽车尾气中初级PM2.5和芳烃等高辛烷值组分，并从根本上减少次级PM2.5的产生；此外，乙醇汽油还可以减少CO、碳氢化合物等有害物质的排放[8-9]。另外，发展以秸秆为原料的纤维素燃料乙醇，可以直接解决因随意焚烧秸秆等农林废弃物带来的大气污染问题，这将是治理大气环境的重要措施之一[10]。通过推广燃料乙醇的使用，可以减少对空气质量的负面影响，降低温室气体的排放，有助于应对气候变化和改善环境质量。

1.2 有助于改善能源结构与安全

将燃料乙醇与传统燃料混合使用或直接作为汽油替代品，可以有效增加清洁能源在交通领域的比重，降低碳排放和减少空气污染。这种转变有助于优化我国能源结构，使其向更可持续和环保的形式迈进[11]。乙醇燃料生产主要依赖于农作物等生物质资源，通过发展燃料乙醇产业，可以减少对进口石油的依赖，这有助于降低能源进口风险，提升我国的能源自给能力[12-13]。此外，燃料乙醇生产可利用农作物秸秆和废弃物等资源，不仅可促进农村经济发展和农民增收，还可进一步增强能源安全和农业可持续发展的协同效应。因此，推广燃料乙醇是实现清洁、安全和可持续能源的关键措施之一。这有助于提升我国的能源自给能力和能源安全水平，同时也符合习近平总书记提出的“双碳”目标和促进经济社会发展全面绿色转型的新理念。

1.3 有助于农业发展与乡村振兴

燃料乙醇的生产需要大量的农作物及其废弃物作为原料，如玉米和甘蔗等，这为农民提供了多元化的市场选择，使他们通过种植农作物就可参与燃料乙醇产业链。农民通过销售农作物获得收入，既促进了农业的发展，又有助于增加农民的收入和提升农产品的附加值[14]。此外，纤维素乙醇可利用农业废弃物，如农作物秸秆、木材废料等进行生物质能源生产。这不仅可以降低农业废弃物引起的环境污染，减少农田秸秆焚烧带来的空气污染问题，还为农民提供了废弃物处理和再利用的机会。同时，工厂的建设需要土地、劳动力和相关设施等，为农业为主的地区带来了投资、就业和经济发展的机会。可见，农民可以通过参与燃料乙醇产业链获得就业机会，提高收入水平，更可促进当地经济的发展。因此，燃料乙醇的发展有利于稳定农业生产，提高农产品的深加工水平，夯实粮食主产区的地位，推动农作物废弃物的高值化利用[15]，更有助于乡村经济振兴。

1.4 有助于创新和科技进步

纤维素燃料乙醇的发展需要在生产、转化和利用等环节进行技术创新和研发。为了实现高效的纤维素水解和发酵，需要进行技术创新和工艺优化，这推动了相关领域的研究和开发，涉及废弃物处理、生物质转化及发酵工程等方面的科学和工程技术[16]。随着科技进步的推动，乙醇产业可以借助新材料、新工艺和智能化技术实现更高效的生产[17]。通过推动纤维素燃料乙醇领域的创新，不仅可以提升能源利用效率，还可以促进相关产业的发展和经济增长[18]。

总之，新时代下纤维素燃料乙醇的发展具有重大意义，它可以为环境保护和碳减排做出贡献，保证我国能源安全及多元化，还能促进农业发展和乡村振兴，同时也可推动技术创新和科技进步。为了实现这一目标，各国政府、企业和研究机构需要加强合作，同时加大科研投入，共同推动纤维素燃料乙醇产业的可持续发展。

2 新时代下继续发展纤维素燃料乙醇的重大挑战

2.1 原料供给的挑战

第一代燃料乙醇使用玉米、甘蔗和马铃薯等糖/淀粉作物作为原料[19]，但其大规模生产对食物供应构成威胁，因此引发了“与人争粮，与粮争地”的问题[20]。为了解决这一问题，人们开始以农业废弃物和木质纤维素材料为原料生产二代燃料乙醇。尽管(转基因)藻类也可作为原料来生产生物能源，但由于藻类的收获困难和前期成本昂贵，现在还无法实现大规模生产[21]。相比之下，二代燃料乙醇具有原料成本低、来源广泛、投资成本也较低且对环境的影响小等优点。近年来，各国陆续建设了纤维素燃料乙醇生产的示范项目[22]。预计二代燃料乙醇工艺有望使美国乙醇年产量增加1倍，巴西乙醇年产量增加3倍以上，可见，未来二代燃料乙醇有望完全取代一代燃料乙醇[23-24]。

2.2 生产工艺的挑战

为了能够与石油的成本相竞争，需要提升燃料乙醇生产工艺中原料转化为糖的技术[25]。在纤维素乙醇生产过程中，工业友好的预处理方法以及后续的酶水解是资本密集型的步骤[26]。预处理通过破坏植物细胞壁致密结构以提升纤维素和半纤维素的可消化性，再通过纤维素酶的协同作用进而释放出糖分子。然而，这些酶在水解过程中面临非生产性结合、酶抑制和反应速率低等问题，使酶解效率和糖产量都降低[27]。因此，降低酶的使用量和成本是一个不可避免的任务，需要寻找更经济高效的酶水解方法或开发更具成本效益的酶。此外，微生物利用可发酵糖进行发酵生产乙醇的工艺也至关重要。通过工艺流程优化或菌株改造来提高发酵效率或实现对木糖的转化，对于木质纤维素精炼具有重要意义。在这里，我们主要综述几种先进生物技术对纤维素燃料乙醇发展的推进作用以及未来的发展前景。

3 推动纤维素燃料乙醇高质量发展的先进生物技术

随着科学技术的快速发展，近年来已经开发出诸多先进的生物技术来推动燃料乙醇的高效生产发展，将从以下4个方面(图1)进行具体阐述。

图1 推动纤维素燃料乙醇高质量发展的先进生物技术Fig.1 Advanced biotechnologies to drive high-quality development of cellulosic fuel ethanol

3.1 发酵工艺优化策略

发酵工艺对燃料乙醇生产的重要性不容忽视。木质纤维素原料经过预处理被转化为可发酵糖的过程会产生很多抑制物。根据预处理工艺的不同，其产生的抑制物类型也有差异[28]：水热法预处理会产生酚类、呋喃和羧酸；酸法预处理会产生乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛(5-HMF)；碱法预处理会产生甲酸、乙酸和酚类物质；机械研磨法会产生酚类和糠醛[29-30]。这些物质对酶活性及发酵微生物的性能产生负面影响，可能引起乙醇产量降低甚至完全抑制乙醇生产。

在传统的生物加工工艺中，分步酶解发酵(SHF)以及同步糖化发酵(SSF)被广泛采用(图2)[31]，而现在开发了统合生物加工(CBP)工艺，表1总结了这3种加工工艺的优缺点。SHF工艺是根据木质纤维素生物转化多步骤的需要，结合现有技术的最直接的策略，将每个步骤在最佳条件下进行。但是SHF工艺存在水解酶的反馈抑制问题，这是因为水解产生的高浓度糖对酶以及发酵微生物产生渗透应激，最终影响生产性能[32]。由于能源需求高、酶成本昂贵以及操作成本高，SHF工艺的工业应用受到限制。

表1 不同纤维素乙醇发酵工艺的优势及局限性

图2 生产纤维素乙醇的方法Fig.2 Processes for cellulosic ethanol production

SSF工艺整合了酶解和发酵步骤，由于这两个步骤是在同一个生物反应器中进行，因此，糖一旦被释放出来，它们就会被转化为乙醇，从而避免糖在抑制水平上的堆积[33]。然而，大多数微生物生产生化产品和生物燃料的最适生长温度是中温，而水解木质纤维素的理想温度超过50 ℃，因此仅适合嗜热微生物发酵工艺。此外，还包括优化水解和发酵工艺参数、解决发酵抑制剂等方面的挑战[34]。

为了克服这些限制，统合生物加工(CBP)工艺提供了一种可持续的策略，即将酶生产、酶解和发酵这3个步骤整合到单个或一组微生物中进行[35]。利用CBP工艺可以减少或消除外源添加酶的需求，并通过在一个容器中同时执行所有步骤来提高效率。然而，目前存在一个限制，即缺乏高效CBP微生物。尽管已经开发了一些非常规微生物作为CBP宿主来生产乙醇[36-38]，但是只有酿酒酵母因其高乙醇生产率和遗传适应性能作为CBP工艺的理想宿主。通过调节酿酒酵母中纤维素酶的表达和拓展酵母可利用的底物谱[34]，将酿酒酵母改造为CBP工艺的宿主是减少对不可再生石油基化石燃料依赖的最有前景的方法之一。

3.2 代谢工程策略

利用木质纤维素生物质高效生产生物燃料主要取决于寻找和开发适合整个发酵工艺的微生物。纤维素乙醇生产的理想菌株应该具备能够完全利用由木质纤维素生物质原料产生的戊糖和己糖，承受高温和低pH，对抑制物和乙醇表现出良好的耐受性以及对乙醇合成具有高代谢通量的能力[39-40]。

代谢工程是一个热点的研究领域，它有助于针对性地重新连接细胞代谢，以提高目标代谢物的浓度、速率和产量。代谢工程在细胞工厂的开发中得到了广泛应用，是设计代谢底盘以目标宿主生产生物燃料的必要条件[41]。目标酶的过表达、基因部件工程、辅因子工程、异源基因表达及竞争途径阻断等代谢工程方法是提高产量的关键解决方案[42]。酿酒酵母作为应用最广泛的细胞工厂之一，是代谢工程改造的首选，因为针对它已开发出多种遗传工具和大量可用的组学数据库[43]。

为了达到生物燃料生产的最高产量，必须克服的关键问题是增强菌株对抑制性化合物、代谢中间体和所需最终产品的耐受性[44]。微生物细胞的生长对于增加生物燃料产量是非常重要的，因此必须设计具有高耐受性的强健菌株，才能实现燃料乙醇生产的高效率和可持续工业化，这可通过理性工程和自适应进化工程来实现[45]。理性工程涉及直接操纵已知的遗传成分，如转录调节子、转运蛋白和已识别的途径酶[44]。自适应进化工程则通过适应或诱变导致菌株进化，然后使用高通量方法筛选出具有高耐受水平的菌株[46]。利用系统生物学技术，可以揭示产生增强菌株耐受性所涉及的因素，再进行遗传开发赋予菌株所需的耐受表型。如，通过重新编程基因转录因子Spt15p可以增强酿酒酵母的葡萄糖/乙醇耐受性[46]。

由于酿酒酵母天然不能利用木糖，导致木质纤维素水解产物中糖的利用不完全，这是纤维素乙醇生产效率较低的问题之一[47]。尽管酿酒酵母不能将木糖转化为乙醇，但在木糖异构酶(XI)存在的条件下，木糖被转化为木酮糖，而木酮糖可以被酿酒酵母转化利用[48]。因此通过挖掘、改造出具有高活性的木糖异构酶十分重要。南京理工大学金明杰教授团队利用大数据挖掘与合理改造的XI，构建并进化出多个能高效利用木糖的酿酒酵母，最终利用经过预处理的无需脱毒或洗涤的玉米秸秆和玉米芯来发酵，乙醇产量分别高达85.95 和94.76 g/L[49]。

3.3 固定化策略

3.3.1 细胞固定化

对纤维素乙醇发酵的细胞固定化方法主要有5种，分别是吸附法、包埋法、膜隔离法、交联法和絮凝法[50]。原则上，使用固定化细胞的连续过程比间歇过程需要更小的反应体积，可以降低成本[51]。固定化已被证明可以提高反应器的生产效率，有助于细胞与液体产物的分离，并促进系统长时间的连续运行[52]。大多数乙醇生产工艺都受到乙醇生产效率低和回收率低的限制以及与所使用的微生物有关的分离问题。在连续系统中，利用固定化细胞可以使生物反应器内细胞密度更高，进而增加乙醇产量并降低生产成本[53]。

此外，当存在抑制剂时，与游离形式相比，多种模式下的固定化细胞都表现出更好的性能[50]。因此，当培养基中存在抑制剂时，细胞固定化已被证明是一种快速且简便的应用策略，可以保护细胞并有助于纤维素乙醇的生产。细胞固定化为纤维素乙醇生产带来了许多优势，包括工艺稳定性、高生产效率、改进污染物控制以及改善的抗抑制剂性能等。细胞固定化由于存在更高的传质限制，细胞形态、代谢和生理特性的改变，细胞的异质分布，成本高等缺点，其大规模的工业应用还远未成为现实[54-56]。未来针对更多其他载体(如生物炭或多物种生物膜)的深入研究将会给燃料乙醇生产带来更大的工业潜力。

3.3.2 纤维素酶固定化

纤维素酶固定化是一种将纤维素酶固定在载体上的技术，在生物燃料、纸浆和纤维素降解等领域的具有广泛潜力。固定化酶技术可以给酶提供更好的保护，提高酶的稳定性，降低酶的失活率，并使酶在不同温度和pH条件下保持较高的催化活性和效率，操作更灵活和重复使用性高，从而促进可持续能源生产和资源回收。常见的载体包括多孔材料、凝胶、微胶囊和纳米颗粒等。

基于酶-酶相互作用的四大类固定化策略已经被广泛研究，即共价键、包封(或包埋)、吸附和交联[57]。固定化技术的正确选择对于特定应用非常重要，因为它直接影响纤维素酶的结构、稳定性和催化活性。载体材料的结构以及疏水性/亲水性、官能度、孔径分布和其他表面特性的信息在固定化技术的选择中起着不可或缺的作用[58]。此前，纤维素酶已成功固定在海藻酸盐、氧化石墨烯、多孔陶瓷珠和硅溶胶-凝胶等材料上，应用于食品、制药和洗涤剂行业[59-61]。在应用这些固定化纤维素酶时，最关键的因素是保留酶再利用的催化活性以及更长的使用时间[62-63]。与传统的支撑材料相比，纳米材料在提高纤维素酶的热稳定性和pH稳定性、回收率、活性和回收能力方面显示出巨大的潜力[64]。然而，仍需要考虑到实际系统的操作稳定性、优化参数、遗传操作以及利用微生物联合等方面，才能进行有效的低成本生物燃料生产。

总之，纤维素酶固定化技术为纤维素降解和生物燃料生产提供了一种经济可行的方法。随着对固定化酶系统的深入研究和技术改进，实现更高效、稳定和可持续的纤维素降解过程，能够为可再生能源领域的发展做出更大贡献。

3.4 酶工程策略

以可再生和可持续的方式，使用定制的纤维素酶混合物来水解木质纤维素生物质，这在能源和增值化学品等生产方面具有巨大的潜力。为了使生物催化剂的使用在工业上更加经济可行，需要对生物催化剂进行定制，使其能承受温度、pH和盐度等恶劣的工艺条件。

酶工程技术是通过改造酶特性进而推动燃料乙醇发展的一个重要研究领域。利用基因工程和生物化学方法，酶工程技术可以改变酶的结构和功能来提高燃料乙醇的生产效率和质量，从而推动燃料乙醇产业的可持续发展。其中，定向进化和(半)理性设计是酶工程技术中改善酶特性的强大技术。如：通过设计纤维素酶的催化位点和底物入口来提升酶活性[65-66]；利用序列比对[67]、折叠自由能分析[68]和B因子引导方法[69]进行合理设计来提高纤维素酶热稳定性；通过定向进化和电荷工程提高纤维素酶在非常规溶剂(离子液体、高盐浓度、有机溶剂)中的耐受性[70-73]和pH稳定性[74-75]等。每种纤维素酶在纤维素降解中都有着特定的作用，利用蛋白质工程可改善纤维素酶在工业应用中缺乏的特性(活性、热稳定性和pH稳定性)或将纤维素酶的应用扩展到更为复杂的酶解环境中。在这方面，有必要注意到，高通量筛选平台的开发及应用是纤维素酶定向进化的瓶颈。一些新的计算设计方法，如通过Framework for rapid enzyme stabilization by computational libraries(FRESCO)[76]、Protein repair one stop shop(PROSS)[77]、FoldX[78]和Constraint network analysis(CAN)[79]进行深入的分析，以预测“小而精”的突变文库，从而定制具有所需特性的纤维素酶混合物。

目前，随着人工智能技术的迅速发展，酶工程技术与人工智能的有效结合为该领域带来了许多新的机遇和挑战。首先，人工智能可以在酶的设计和优化中发挥重要作用。通过机器学习和深度学习算法，可以分析大量的酶结构和功能数据，以预测新酶的性能并进行合理的设计[80]。其次，人工智能可以帮助预测和优化酶的反应条件和催化机制。通过建立模型和算法，可以对酶催化反应的动力学和热力学进行准确预测，以优化反应条件和提高反应效率。这种预测能力对于酶催化的燃料乙醇生产过程的优化非常重要[81]。最后，通过分析大规模的基因组和代谢组数据，人工智能可以揭示酶与代谢途径的关系，从而指导燃料乙醇生产的优化和调控[82]。因为相关算法可以帮助识别潜在的酶基因和代谢途径，进而设计更高效的代谢工程策略。

综上所述，通过人工智能在酶设计、反应条件优化和代谢工程中的应用，可以提高燃料乙醇的生产效率和质量，促进可持续能源的开发和利用。随着酶工程和人工智能技术的不断进步，研究人员将获得更多创新成果和技术突破以推动燃料乙醇等生物产业的发展。

4 结论与展望

选择合适的预处理方法是提高酶解效率的首要前提，从商业化角度来说，高效且经济的预处理必须满足减少水用量和降低能源需求、减少抑制剂的产生、实现低成本的催化剂回收和减少废物产生等要求。

预处理之后的酶解步骤成本占纤维素燃料乙醇生物精炼厂总成本的近25%，酶工程技术的快速发展可以加速实现所需酶特性的提升从而极大地减少酶的用量。因此，需要寻找合适的宿主并通过基因编辑来调整酶产量以经济生产高效的酶混合物，进而将纤维素生物质原料转化为可发酵糖，最终供微生物生产燃料乙醇和其他高值化学品。

微生物是燃料乙醇生产的主要参与者，因此微生物代谢工程对于生物燃料生产行业的进步是不可或缺的，通过代谢工程可以增加微生物的耐受性、利用底物的能力、提高代谢通量、设计新的代谢途径。为了实现这些目标，研究人员必须开发全基因组测序、生物信息学、系统生物学、蛋白质组学和代谢组学等新技术来充分了解酿酒酵母或非常规微生物中的重要代谢途径并确定相关的酶。再通过利用计算工具和先进技术进行微生物的筛选和代谢途径改造，最终以提高纤维素燃料乙醇的工业生产效率，降低生产成本。

如今，随着各种先进生物技术的发展，纤维素乙醇工艺的各个单元(预处理、酶解、发酵等)效能都得到了有效的提升，但是如何将各种工艺技术集成到一个乙醇工程中也是一个重大挑战。由于CBP工艺对于微生物菌株的要求极高，一种将酶生产和糖化步骤整合的综合生物糖化(CBS)工艺被提出。该方法将发酵步骤分开，可以利用生产的糖来生产除了燃料乙醇之外的其他增值产品。当然，CBP或CBS工艺在商业规模上的实现需要高活性稳健催化剂的存在。未来，也需要越来越多的实验室规模研究转向工业规模的放大研究，以评估这些工艺在工业生产中的可行性，最终实现具有经济效益的燃料乙醇规模化生产。