大鼠神经性勃起功能障碍模型在实验中的应用

胡轩韩　钱麟　魏海彬　徐智慧

摘要：勃起功能障碍（ED）是指阴茎持续不能达到和/或维持足够的勃起以获得满意的性生活。ED对于患者及其性伴侣的生活质量会带来较大的影响。近些年来，为阐明ED的病理生理机制，多种ED动物模型应运而生，并取得了一系列的进展。啮齿类动物的海绵体神经（CN）在解剖上与人类相近，且具有性价比高、粗大易辨认等优势，逐渐成为ED动物模型的主流。本文回顾了近年来大鼠双侧CN损伤所致神经性ED动物模型的建立方式，总结了其模型的检测及评价指标，探讨了ED动物模型在基础实驗研究当中的应用及进展。

关键词：海绵体神经损伤；勃起功能障碍；大鼠；动物模型

中图分类号： R332文献标志码： A文章编号：1000-503X（2023）02-0311-06

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.14954

Application of Rat Model of Neurotic Erectile Dysfunction in Experiment

HU Xuanhan QIAN Lin WEI Haibin XU Zhihui2

ABSTRACT：Erectile dysfunction （ED） refers to the persistent inability to achieve and/or maintain a sufficient erection of the penis to obtain a satisfactory sexual life，which affects the quality of life of the patients and their sexual partners.To decipher the pathophysiological mechanism of ED，researchers have established a variety of animal models and achieved a series of progress.The cavernous nerve （CN） of rodents，anatomically similar to that of humans，is cost-effective，thick，and easy to be identified，which has gradually become the mainstream of animal models.In this paper，we reviewed the modeling methods of the neurological ED caused by bilateral CN injury in rats in recent years，summarized the model evaluation indicators，and discussed the application and progress of ED models in basic experimental research.

Key words：cavernous nerve injury；erectile dysfunction；rat；animal model

Acta Acad Med Sin，2023，45（2）：311-316

勃起功能依赖于神经和血管的相互作用，需要中枢神经、脊髓骶骨节段的副交感神经、阴部内动脉、环状静脉、背深静脉等神经或血管通路共同完成。因此，通路中的任何损害皆可导致勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）［1］。器质性ED根据损伤机制的不同又可分为血管性ED、神经性ED、内分泌性ED、药物性ED和平滑肌损伤性ED［2］。神经性ED是神经末梢、阴部神经、脊髓，或诱发勃起的大脑中枢病变的结果。在前列腺根治性切除术（radical prostatectomy，RP）中，海绵体神经（cavernous nerve，CN）损伤可能是RP术后神经性ED的主要原因［3］。Haglind等［4］的研究显示，即使接受微创的机器人辅助下前列腺癌根治术，在术后12个月时，仍有高达70.4%的患者勃起功能未恢复。

雄性大鼠的海绵体神经位于其前列腺背外侧盆神经节（major pelvic ganglion，MPG）的下游，从MPG发出分支后向内下方的尿道括约肌方向走行。与其他哺乳动物相比，大鼠的相对成本较低，在基础研究领域的应用更加广泛，因而是一种比较标准化的ED动物模型。本文回顾了近年来大鼠双侧CN损伤所致神经性ED动物模型的建立方法，总结了神经性ED动物模型的检测及评价指标，探讨了神经性ED动物模型在基础实验研究当中的应用及进展。

手术流程

本文中所涉及大鼠均为Sprague-Dawley（SD）大鼠。选取大鼠在麻醉状态下进行手术，根据实验条件可选用2.5%～3.0%的异氟醚、戊巴比妥钠（50 mg/kg）、55～75 mg/kg氯雷他定联合盐酸塞拉嗪等药物腹腔注射麻醉。先将大鼠以仰卧位放置在加热垫上，进行常规的腹部消毒，在耻骨联合至中腹部做一个中线切口，依次暴露膀胱、前列腺。在前列腺两侧叶的背外侧寻找MPG，CN是MPG发出的分支当中较为粗大的一支、且在直肠和尿道之间的凹槽中向尾部延伸。在显微镜下暴露CN，根据建模的不同选择合适方式损伤双侧CN，关闭腹腔并缝合切口［5-6］。

CN损伤模型

CN损伤模型根据术中损伤类型的不同可分为牵拉模型、挤压模型、冷冻模型、横切模型、切除模型。CN损伤是实验的中心环节之一，然后配合不同的方法、手段、策略组成实验方案，如与勃起刺激方法（药物、电刺激）、勃起监测手段（海绵体内压、交配实验）、ED治疗策略（神经移植、干细胞治疗、药物治疗）等相结合。根据研究终点的不同，可选取不同的实验方案进行研究。

牵拉模型 在RP手术中，由CN参与构成的血管神经束是前列腺筋膜的重要组成部分，无论术中如何注意保护血管神经束，都无法避免直接或间接牵拉CN，因此牵拉模型常用来评估其对勃起功能的影响。Li等［7］研究表明，CN不受物理损伤下的最大拉力是0.2 N，CN牵拉2 min后，引起海绵体内压（intracavernous pressure，ICP）/平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）值明显下降，阴茎背神经神经纤维数量减少，海绵体胶原纤维/平滑肌比例升高，细胞凋亡增加，证实CN牵拉是一种有效的制造CN损伤模型手段。由于牵拉模型对于双侧CN损伤较轻，大鼠的勃起功能往往为一过性损伤，在1～2周内可以缓慢恢复。基于上述特点，牵拉模型常用于验证药物的疗效实验中。

挤压模型 双侧CN挤压伤造模是模拟保留神经血管束的RP的主要模型，在基础研究领域应用最为广泛。由于造模的工具（止血钳、镊子、动脉夹）和挤压持续时间的不同，目前尚无国际统一的造模方式。在Sezen等［8］的研究中，用镊子挤压双侧CN 15 s，反复3次，即可造成ICP下降至正常组大鼠的50%。Cong等［9］使用非锯齿状止血钳挤压双侧CN 2 min，术后大鼠均表现为重度ED。相较于牵拉模型，挤压模型更贴近筋膜内保留神经血管术的RP。目前已有一系列研究将干细胞、神经生长因子、中药、电针等诸多疗法应用于该模型中。然而由于造模方式的不同，各研究中大鼠海绵体损伤程度并不一致，难以横向对比同类研究，未来应考虑界定标准的造模方式。

冷冻模型 1996年，美国泌尿外科协会正式将冷冻疗法作为前列腺癌的治疗选择之一，其优势在于住院时间短、复发率低、无复发生存率高等，然而由于多次的冻融循环及扩展至腺体外侧的冷冻，极易损伤CN，引起术后ED（50%～90%）［10］。Yang等［11］将放置于液氮中的钢棒接触大鼠双侧CN 20 s，间隔1 min后，再度接触20 s，以模拟冷冻消融术，结果显示阴茎背神经中神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS） 显著减少，阴茎海绵体萎缩，血管窦内平滑肌细胞凋亡明显增加。目前冷冻消融治疗在国内开展较少，关于大鼠的冷冻模型仅有1篇文献报道，后续仍需进一步实验研究的证实。

横切模型 横切模型主要模拟筋膜外RP手术，术中切断双侧CN后，神经轴突及外鞘的连续性中断，造成了不可逆的损伤，但保留了CN神经切开的两断端，理论上存在轴突再生及神经再连接的可能性。在Cho等［12］的研究中，用显微外科剪切断双侧MPG远心端5 mm的海绵体神经，术后1周提示平滑肌/胶原比例显著下降，术后8周较前有所恢复，提示术后8周时受损的CN神經已部分完成轴突再生及神经再连接。与挤压模型相比，横切模型双侧CN损伤更为严重，研究中往往会通过局部予新型材料或移植自身组织等手段促进CN再生，而单一的药物疗法在横切模型中效用并不显著，因此横切模型常被用于模拟重度ED，研究双侧CN切断后的病理生理学改变，以及测定新型材料和自体组织对于CN的再生和勃起功能的恢复和改善程度情况。

切除模型 与横切相比，切除是更彻底的破坏，意味着CN片段的缺失，根据切除工具的不同，可分为普通切除及消融切除。Ying等［13］用显微外科剪在双侧CN上各切除8 mm，结果发现海绵体神经nNOS相较于对照组明显下降。Li等［14］比较切除模型和挤压模型，结果显示相较于挤压模型，切除模型引起的ED更严重，表现为不可逆性的ED，更适合用于长期研究。由于CN节段的切除，两侧断端分离，神经无法自主再生，因此常用自体组织或外源性材料替代切除节段，观察大鼠勃起功能恢复状况。目前常用自体神经、细胞洗脱支架或海藻酸盐凝胶等作为移植物，通过负载不同的药物或细胞，测定在大鼠切除模型中的疗效。相比于筋膜内的RP，筋膜外的RP手术难度较低，切除越彻底，术后ED发生率越高。横切模型和切除模型模拟了筋膜外的RP，为接受该手术的患者提供了治疗ED的基础。切除模型常被用于研究神经移植替代物在重度ED的疗效。

CN损伤模型造模方式、优势、劣势简单列表如下（表1）。

ED的检测及评价方法

随着ED检测技术的进步，评价方法不再局限于原有的生物行为学研究和分子生物学研究，根据评价方式的类型，一般分为以下3类：（1）功能学评价，如勃起功能评价、交配实验等；（2）常规分子生物学评价，如HE染色、蛋白印迹分析、免疫组织化学、免疫荧光、Masson染色、甲苯胺蓝染色、透射电镜等方法；（3）生物信息学评价，如蛋白组学、基因组学等方法。

勃起功能评价 测量大鼠阴茎ICP等是评价大鼠勃起功能的主要手段，ICP最早由Lewi等［15］提出，主要采用穿刺测压法。具体操作为：常规麻醉、消毒，在下腹部切开5 cm左右正中切口，暴露海绵体和白膜，将注射器与压力传感器相连接，将含有肝素生理盐水的注射器插入海绵体组织中，记录ICP；以同样的方法，将含有肝素生理盐水的PE-50管插入大鼠的左颈动脉，检测MAP；在不同电压或电流刺激下，用双极电极钩施加于双侧或单侧CN，记录刺激期间的压力数据，并计算最大ICP与相应MAP之间的比值（ICP/MAP）［16-18］。该方法有一缺陷，即在电极施加于CN的过程中，机械牵拉、电流刺激等可能会对CN造成潜在损伤，从而影响实验结果，仍需要进一步改进。

蛋白印迹分析 测量海绵体组织、CN、阴茎背神经中的相关蛋白成分也是评价ED的检验方法之一。通过收集大鼠的阴茎海绵体组织、CN组织、背神经组织，进行蛋白质印迹分析以量化蛋白质表达，根据image J软件评估每种蛋白质与β-肌动蛋白的相对定量，从而评价CN损伤后ED的程度［16］。

组织学评估 在两侧前列腺腺叶外侧的CN受损后，海绵体的窦腔内出现血管内皮细胞及平滑肌细胞凋亡、纤维化等一系列表现，可用于评估阴茎海绵体组织中平滑肌变化；Masson染色通过平滑肌/胶原评估海绵体纤维化程度；甲苯胺蓝染色通过显微镜下CN轴突的计数来评估神经的再生修复情况［19-20］。

凋亡细胞检测 除了应用蛋白印迹法进行凋亡相关蛋白的检测外，还可以在细胞层面进行凋亡细胞的检测。Fall等［21］通过原位细胞凋亡试剂盒测定和量化海绵体组织中的凋亡细胞，进而通过计算凋亡细胞数量和细胞总数的比例以确定凋亡指数，发现大鼠双侧CN损伤5周后，海绵体组织弥漫性凋亡，海绵体动脉的平滑肌细胞和内皮细胞也发生凋亡。

交配实验 交配实验是目前较为常见的实验手段，能直观评估大鼠的勃起功能。通过诱导交配行为，设置插入潜伏期、导入潜伏期、射精潜伏期、射精后间隔期、射精频率、交配间隔等一系列的参数来评价勃起功能。具体操作为诱导雌鼠发情，之后将雌鼠放置在一处环境安静、光线适度的观察笼中，经过10 min的适应期后，将雄鼠放入观察笼内，实验持续30 min，记录相关参数［22-23］。交配实验易受环境、药物、大鼠主动性等多种因素影响，即使是正常勃起的大鼠，也可能有阴性表现，因此该实验仍存在一定的局限性。

神经性ED动物模型在药物治疗领域的应用

随着ED研究的深入，越来越多的基础实验开始将侧重点聚焦于应用研究，传统的药物治疗如磷酸二酯酶-5抑制剂是目前治疗ED最常见的药物之一。随着神经生长因子的研究深入，可以通过一系列信号通路调节神经元功能和状态，从而改善海绵体神经损伤所致ED，如文献报道脑源性神经营养因子、生长分化因子-5、胶质细胞源性神经营养因子等与勃起功能的恢复相关［24］。此外由于激酶在细胞信号传导中的关键作用，一系列研究报道了其在ED中的应用，如转化生长因子-β、Rho激酶/Akt通路、LIMK通路等被报道与细胞的凋亡和海绵体纤维化相关［25］。传统中医药治疗ED的配方在我国源远流长，对于RP术后导致的ED，中医多认为是气虚血瘀所致。Ma等［26］给CN损伤大鼠每日灌胃紅景Ⅰ号方，发现红景Ⅰ号方不仅促进了神经丝蛋白-200，生长相关蛋白-43、nNOS等因子的表达，还能促进神经生长、平滑肌细胞增殖，从而提高勃起硬度、恢复勃起功能。

神经性ED动物模型在干细胞治疗领域当中的应用

干细胞疗法可能为将来的ED治疗提供持久的、有效的治疗选择，目前已有大量基础研究报道各类干细胞用于治疗神经性ED［27］。Ying等［28］将脂肪源性干细胞注射到挤压模型大鼠的海绵体中，发现脂肪源性干细胞可有效缓解海绵状神经损伤及海绵体纤维化程度，改善勃起功能。将来的干细胞若进入临床应用，还需解决如下问题：（1）商品化问题：如何将干细胞标准化及商品化统一；（2）来源问题：自体/异体来源的比较，间充质干细胞及诱导性多能干细胞的细胞来源比较；（3）不良反应问题：比如成瘤、致畸等问题；（4）作用机制问题：比如干细胞在体内的定位及作用方式等，均需要进一步地深入研究。

总结

大鼠双侧CN损伤所致的神经性ED动物模型是目前ED动物模型的主流，根据损伤方式不同，可分为牵拉模型、冷冻模型、挤压模型、横切模型、切除模型。因为研究目的决定了大鼠模型的选择以及相应的ED评价手段，所以为了研究的成功，了解各种ED动物模型的适用条件和选择合适的ED检测方法至关重要。在牵拉和挤压模型中，海绵体神经通路仍有保留，大鼠可逐渐恢复勃起功能，所以牵拉或挤压模型适合药物或神经生长因子等对于勃起功能的恢复为研究终点选用。而在切断和切除模型中，下游的血管、平滑肌失神经支配，往往会发生不可逆的生理功能缺失，因此，建议当研究终点为海绵体组织形态学、分子生物学改变等，可选用横切或切除模型。目前临床上治疗神经性ED以磷酸二酯酶-5抑制剂最为常见，国内常常会加用中药以调节气血，辅助恢复勃起功能，其余诸如干细胞疗法、激酶抑制剂等大多仍处于临床前实验阶段，目前应用较少，仍需进一步深入研究。

参 考 文 献

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（收稿日期：2022-02-25）

基金項目：浙江省卫生健康科技计划项目（2021KY449）