miR-93-5p对缺氧/复氧H9c2心肌细胞凋亡的作用机制研究

刘 斌,刘 娜,曹广林

随着生活方式的改变和生活节奏的加快,心血管疾病的发生率逐渐趋于年轻化。心肌缺血再灌注损伤造成的心肌细胞凋亡和线粒体功能障碍是心肌缺血再灌注病人发生心力衰竭的主要原因[1]。研究表明,降低炎症反应和氧化应激水平可明显减少心肌细胞凋亡,改善线粒体功能障碍[2]。miRNA是一种单链非编码RNA,研究发现,多种miRNA参与调节心肌缺血再灌注损伤[3-5],miRNA-93-5p对脓毒症造成的心肌损伤以及糖尿病肾病等具有保护作用[6-7]。本研究旨在探讨miR-93-5p在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌细胞中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系

大鼠H9c2心肌细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 试剂及仪器

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物有限公司;miR-93-5p阴性对照片段以及miR-93-5p mimic购自上海吉玛制药技术有限公司;miR-93-5p和U6的聚合酶链式反应(PCR)引物序列购自中国广州锐博公司;兔抗大鼠活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specificproteinase-3,Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗购自英国Abcam公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Sigma公司;DMEM培养基购自北京华美试剂公司;超净工作台购自沈阳市医疗器械二厂;培养箱购自美国NAPCO公司。

1.3 分组及给药

将H9c2心肌细胞接种到含有10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养,置于37 ℃ 5%CO2的恒温培养箱中孵育,当细胞融合度达到90%时,进行传代。取第4代对数生长期的细胞用于实验。将细胞分为对照组(control组)、H/R组、miR-93-5p阴性对照组(miR-NC组)、miR-93-5p模拟物组(miR-93-5p mimic组)。miR-NC组转染miR-93-5p阴性对照片段50 μmol/L,miR-93-5p mimic组转染miR-93-5p模拟物50 μmol/L。24 h后,除control组外,其余3组建立H/R模型。首先,将不含血清和糖的DMEM培养基用混合气体(95%N2和5%CO2)平衡2 h制备饱和缺氧液,将心肌细胞中原有的培养液弃掉,加入饱和过的缺氧液,并放置在37 ℃含有95%N2和5%CO2的培养箱中培养10 h,建立缺氧模型。10 h后,弃掉缺氧液,加入含糖和10%胎牛血清的DMEM培养基,置于37 ℃含有95%O2和5%CO2的培养箱中,培养2 h,建立复氧模型。control组心肌细胞置于含糖和10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,置于37 ℃含有95%O2和5%CO2的培养箱中孵育。

1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定miR-93-5p的表达水平

复氧结束后,弃去细胞培养液,磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗2次,Trizol试剂完全裂解细胞,细胞裂解液用氯仿抽提,异丙醇沉淀后,收集总RNA。紫外分光光度计鉴定RNA浓度和纯度。取1 μL样品进行反转录,荧光定量PCR仪进行扩增,反应条件为95 ℃ 2 min;95℃ 30 s;58 ℃ 40 s;共40个循环。所有样品均进行5次重复操作。以U6作为内参,采用2-△△Ct法计算miR-93-5p的相对表达水平。miR-93-5p的引物序列见表1。

表1 基因及引物序列

1.5 噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率

各组心肌细胞复氧结束后,MTT比色法检测心肌细胞存活率。将细胞制成细胞悬液,接种于96孔板中,每孔3 000个细胞,每孔中再加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL,37 ℃培养箱中孵育4 h。弃去上层清液后,每孔再加入200 μL的二甲基亚砜,振荡孵育10 min后,放置在酶标仪上,设定波长为490 nm,测定A值,参照试剂盒说明书指定标准曲线,根据标准曲线计算心肌细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.6 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率

各组心肌细胞复氧结束后,胰酶消化细胞,PBS洗涤重悬,加入500 μL缓冲液混匀,取100 μL细胞悬液加入膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)孵育10 min,然后加入碘化丙啶(PI)孵育15 min。使用流式细胞仪和Flowjo软件分析心肌细胞凋亡率。

1.7 氧化应激损伤指标检测

各组心肌细胞复氧结束后,弃掉细胞培养基,收集细胞,冰浴中用超声细胞粉碎仪处理30 s,之后,4 ℃下3 500 r/min离心10 min,收集上清。根据各试剂盒说明书,用紫外-可见分光光度计平行测定各组细胞裂解液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,硫代巴比妥酸法测定MDA含量,二硫双硝基苯甲酸定量法检测GSH-Px活性。

1.8 ELISA检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达

各组心肌细胞复氧结束后,收集上清液检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达。首先,用包被液稀释包被抗原,最适浓度为5～20 μg/mL,450 nm波长处测定A值,根据说明书建立标准曲线,由标准曲线计算含量。反应板每孔各加入0.3 mL,37 ℃水浴2 h,弃掉包被液,加入洗涤缓冲液洗涤。每孔加入经稀释过的待测上清液0.2 mL,37 ℃水浴2 h。洗涤后,每孔加入稀释过的酶结合物0.2 μL,37 ℃水浴2 h。洗涤后,加入邻苯二胺溶液0.2 μL,室温静置30 min,每孔加入0.05 μL终止液。酶标仪波长调至490 nm处,测量A值。

1.9 蛋白免疫印迹法检测心肌细胞中蛋白表达

各组心肌细胞复氧结束后,弃去上清液,预冷过的PBS洗涤各组细胞,各洗3次,加入50 μL的RIPA裂解液,置于冰上30 min,4 ℃下12 000 r/min离心10 min,收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。按照实验分组依次加入各蛋白样品20 μL,120 V恒压电泳,直至溴酚蓝达到凝胶底部,结束电泳。采用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,0.3 A恒流湿转2 h,室温封闭1 h,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜,二抗(1∶5 000)室温孵育2 h,增强化学发光试剂(enhanced chemiluminescence,ECL)法显色,Image J软件分析蛋白条带灰度值,以目的蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.10 统计学处理

2 结 果

2.1 各组心肌细胞中miR-93-5p表达比较

各组miR-93-5p表达比较,差异有统计学意义(P<0.001)。与control组比较,H/R组miR-93-5p表达降低(P<0.05);与H/R组比较,miR-93-5p mimic组miR-93-5p表达升高(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-93-5p mimic组miR-93-5p表达升高(P<0.05)。详见表2。

表2 各组心肌细胞中miR-93-5p表达比较

2.2 各组心肌细胞存活率比较

各组心肌细胞存活率比较,差异有统计学意义(P<0.001)。与control组比较,H/R组心肌细胞存活率降低(P<0.05);与H/R组比较,miR-93-5p mimic组心肌细胞存活率升高(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-93-5p mimic组心肌细胞存活率升高(P<0.05)。详见表3。

表3 各组心肌细胞存活率比较 单位:%

2.3 各组心肌细胞凋亡率比较

各组心肌细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.001)。与control组比较,H/R组心肌细胞凋亡率升高(P<0.05);与H/R组比较,miR-93-5p mimic组心肌细胞凋亡率降低(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-93-5p mimic组心肌细胞凋亡率降低(P<0.05)。详图1、表4。

表4 各组心肌细胞凋亡率比较 单位:%

2.4 各组氧化应激指标SOD、MDA、GSH-Px水平比较

各组SOD、GSH-Px、MDA水平比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。与control组比较,H/R组SOD、GSH-Px水平降低,MDA水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与H/R组、miR-NC组比较,miR-93-5p mimic组SOD、GSH-Px水平升高,MDA水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表5。

表5 各组氧化应激指标SOD、MDA、GSH-Px表达比较

2.5 各组炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

各组TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。与control组比较,H/R组TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);与H/R组、miR-NC组比较,miR-93-5p mimic组TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。详见表6。

表6 各组炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 单位:ng/L

2.6 各组心肌细胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

各组心肌细胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。与control组比较,H/R组Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与H/R组、miR-NC组比较,miR-93-5p mimic组Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表7、图2。

图2 各组心肌细胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达条带图

表7 各组心肌细胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

3 讨 论

缺血再灌注时心肌细胞由长时间的缺血缺氧状态到吸入大量的氧气和营养物质,导致线粒体功能损伤,活性氧过度产生,氧化应激水平升高,诱导心肌细胞凋亡。心肌细胞损伤触发炎症反应,大量炎性因子释放,进一步加重心肌细胞凋亡。过度的炎症反应和氧化应激水平引起细胞凋亡、纤维化和细胞自噬[8-11],抑制炎症和氧化应激水平可减少心肌缺血再灌注或H/R诱导的心肌细胞凋亡[12]。既往研究表明,miR-93-5p通过调节Toll样受体4(TLR4)/髓分化因子88(MyD88)/核转录因子κB(NF-κB)信号通路抑制脂多糖造成的炎症反应,改善急性肺损伤[13]。本研究通过建立H/R心肌细胞模型,探讨miR-93-5p对H/R造成的心肌细胞损伤的影响。

SOD和GSH-Px是广泛存在于细胞内的一类抗氧化酶,线粒体损伤时,过度产生活性氧,使氧化应激水平升高,而GSH-Px可有效清除活性氧,保护线粒体结构和功能完整。SOD具有清除超氧阴离子的作用,保护细胞免受损伤,其活性的高低间接反映机体清除氧自由基的能力[14],而MDA水平则间接反映氧自由基对细胞损伤的程度。心肌细胞损伤触发TNF-α的释放,进一步刺激炎性因子的分泌,如IL-1β、IL-6、黏附分子等,而促炎因子的大量分泌,会进一步加重心肌损伤。在本研究中,心肌缺血再灌注时,SOD和GSH-Px活性降低,MDA水平升高,炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,由于活性氧和氧自由基清除受到阻碍,以及促炎因子大量释放,导致心肌细胞存活率降低、凋亡率升高。miR-93-5p参与调节多种生理过程,如高糖诱导的细胞增殖、迁移、纤维化及心肌细胞凋亡等[15-16]。为了探讨miR-93-5p对H/R造成的心肌细胞损伤是否具有保护作用,采用miR-93-5p mimic孵育心肌细胞后,建立H/R模型。实验结果显示,miR-93-5p过表达增强SOD、GSH-Px活性,降低MDA以及炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平,心肌细胞存活率升高,凋亡率降低,表明,miR-93-5p通过降低氧化应激水平和炎症反应,改善H/R诱导的心肌细胞损伤。

细胞凋亡受到促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的共同调控,两类凋亡蛋白失衡,导致细胞凋亡发生。Caspase家族是一组半胱氨酸蛋白酶,在调节细胞凋亡的过程中发挥重要作用,其中Caspase-3位于凋亡级联反应的关键位置,是重要的凋亡蛋白酶。Bcl-2家族同样是调节细胞凋亡的重要家族,Bcl-2通过干扰细胞色素C的释放,阻断Caspase蛋白酶的激活,抑制细胞凋亡。Bax作为Bcl-2家族重要的促凋亡蛋白,其表达水平与细胞凋亡密切相关。Bax是线粒体膜上离子通道的组成部分,可以使细胞色素C穿过线粒体膜,激活Caspase-3,促进细胞凋亡[17]。本实验通过蛋白免疫印迹法检测凋亡蛋白表达情况,H/R使心肌细胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低,miR-93-5p过表达使Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高。本实验结果表明,miR-93-5p通过调节凋亡相关蛋白表达,抑制细胞凋亡。

综上所述,miR-93-5p可有效抑制H/R诱导的细胞凋亡,可能是通过调节凋亡相关蛋白表达,抑制炎症反应和降低氧化应激水平发挥作用,为临床治疗心肌缺血再灌注提供理论支持。