葡萄籽多酚对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡及TLR4/NF-κB蛋白的影响

武报佳,邢慧敏,郭 华,赵 睿,孙 波,李 燕

急性心肌梗死(AMI)是心血管系统常见疾病,多指冠状动脉损伤导致血流减少或中断,心肌组织长时间缺血导致,是一种急性冠脉综合征[1]。流行病学调查显示,AMI病人发病主要集中在欧美国家,美国发病率为508/10万且逐年升高,我国AMI发病率为45/10万～55/10万,临床表现为心前区疼痛或出现憋闷,发病人群存在年轻化趋势,45岁以下为高发人群[2]。以往研究表明,成熟的心肌细胞不会发生凋亡,缺血缺氧是导致心肌细胞死亡的主要原因[3]。近些年相关文献证实,AMI疾病出现再灌注损伤时会导致心肌细胞凋亡,其产生机制是由多种信号通路共同参与导致。Toll样受体(TLRs)是一种重要模式识别受体家族,TLR4是其家族成员之一,在心肌细胞中表达[4]。髓样分化因子(MyD88)联合TLR4后能够激活核转录因子-κB(NF-κB)而发挥信号传导作用。体外实验证实,心肌缺血再灌注大鼠NF-κB能够激活JNK1/2导致NF-κBp65核转位而加快心肌细胞凋亡[5-6]。葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)是一种天然植物多酚,其活性成分包含酚酸类物质茶儿素及黄烷醇类。GSP在食品和保健品的研究较广泛,已经证实GSP在心血管疾病中具有保护作用[7]。本研究观察GSP对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡及TLR4/NF-κB蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体(SPF)级SD雌性大鼠,鼠龄6周,共60只,均购自浙江维通利华实验动物技术有限公司,体质量200～300 g,动物许可证号:SCXK(浙)2019-000l。饲养在湿度55%、温度25 ℃的环境下,模拟黑白交替无菌饮食2周,定时清洗、消毒鼠笼,实验要求符合《实验动物管理条例》管理规定。

1.2 主要药物、试剂与仪器

GSP购自中国西安双德生物;阿托伐他汀购自中国北京嘉林药业;戊巴比妥钠、阿托品、氯胺酮、地西泮(安定)及注射用青霉素钠均购自中国广州粤丰公司;TLR4、NF-κB抗体均购自Abcam;封闭用正常山羊血清购自中国北京百奥莱公司;苏木精-伊红(HE)试剂盒购自西安永屹生物技术;FlexiWash全自动蛋白质免疫印迹系统购自环亚生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 AMI建模方法

测量60只大鼠体质量,清除气管分泌物,腹腔注射60 mg/kg的阿托品、5 mg/kg的地西泮及30 mg/kg的氯胺酮麻醉,将大鼠仰卧位后固定于操作台上,暴露胸部连接小动物呼吸机,剔除左侧胸腔毛发消毒后,在第4肋、第5肋间切开皮肤,置入开胸器暴露心脏,剪开心包,于肺动脉及左侧心耳距离主动脉根部0.2 cm分别用4号线及8号手术针结扎左冠状动脉前降支,建立心肌梗死模型,撤离开胸器,青霉素冲洗胸腔后用2号线缝合皮肤,大鼠清醒后拔出呼吸机。假手术大鼠除不结扎左冠状动脉前降支外其余同上。

1.3.2 分组及干预方法

将60只大鼠分为假手术组、AMI组、低GSP组、中GSP组、高GSP组及药物对照组,每组10只,低GSP组、中GSP组、高GSP组分别采用100、200、300 mg/kg的GSP溶液灌胃,药物对照组采用20 mg/kg的阿托伐他汀灌胃,假手术组大鼠灌胃同体积的生理盐水。每日1次,连续灌胃1周。

1.3.3 心肌梗死体积和含水量检测

末次灌胃后,各组随机选取3只大鼠颈部脱臼处死大鼠,提取心脏的心肌组织,低温保存。30 min后沿着房室沟方向平行切片,放入2%的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液后避光孵育30 min,6 min反转1次,采用图像分析系统计算心肌梗死体积(白色为梗死区)。另每组随机选取3只大鼠脱臼处死后,提取左侧心脏组织,生理盐水冲洗后拭干水分,采用电子天平称量湿度,95 ℃烘干后称量干度,含水量(%)=(湿度-干度)/湿度。

1.3.4 心肌组织HE染色

剩余各组大鼠脱臼处死,提取心脏,石蜡包埋心肌组织,5 μm切片,脱蜡10 min后利用95%乙醇水化,采用碱性苏木精染色15 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次,蒸馏水清洗,再利用0.5伊红染色3 min,PBS透明,在200倍的显微镜观察心肌组织病理改变。

1.3.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测各组大鼠心肌细胞凋亡

石蜡切片进行TUNEL染色,检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况,方法步骤按TUNEL试剂盒说明书进行。每张切片随机选取不交叉重复的5个视野在光学高倍显微镜下进行观察,出现棕黄色颗粒状为细胞凋亡。心肌细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.3.6 蛋白免疫印迹法检测心肌组织TLR4/NF-κB蛋白表达

心肌组织加入0.125%胰蛋白裂解液,4 000 r/min离心后,在血清样品中加入样孔。进行电泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)浸泡10 min,反复PBS冲洗,每次5 min,分别加入TLR4/NF-κB及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(1∶500)、过氧化物酶标记二抗(1∶2 000),杂交处理4 h后,冲洗,将膜浸入增强化学发光试剂(ECL)工作液,检测获取图像。

1.3.7 逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测心肌组织TLR4/NF-κB mRNA表达

心肌组织经0.125%胰蛋白酶消化,冲洗后放于无菌试管管中,提取其RNA,75%乙醇离心,-80 ℃保存。将RNA转化DNA,加入TLR4及NF-κB抗体,内参采用GAPDH,60 ℃预变性,10 min,95 ℃变性,72 ℃退火,各30 s,95 ℃延伸,5 min,循环次数以40次为准,用2-ΔΔCt的方法计算相对表达水平,引物序列见表1。

表1 基因名称及引物序列

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌梗死体积及心肌组织含水量比较

与假手术组比较,AMI组心肌梗死体积增大(P<0.05);与AMI组比较,低GSP组、中GSP组、高GSP组和药物对照组心肌梗死体积减小(P<0.05);与假手术组比较,AMI组心肌组织含水量升高(P<0.05),与AMI组比较,高GSP组和药物对照组心肌组织含水量降低(P<0.05)。详见表2、图1。

图1 各组大鼠心肌梗死体积比较

表2 各组大鼠心肌梗死体积及心肌组织含水量比较 单位:%

2.2 HE染色观察心肌组织病理形态

假手术组大鼠心肌细胞排列整齐,结构完整,无炎症浸润;AMI组大鼠心肌细胞紊乱及数目减少,排列紊乱出现大量肌肉丝溶解及炎症浸润,与AMI组比较,低GSP组、中GSP组、高GSP组和药物对照组心肌细胞紊乱有效改善,炎症浸润逐渐降低。详见图2。

图2 HE染色观察各组大鼠心肌组织病理形态(×200)

2.3 TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况

AMI组心肌细胞凋亡率高于假手术组(P<0.05),与AMI组比较,低GSP组、中GSP组、高GSP组和药物对照组心肌细胞凋亡率均降低(P<0.05),且高GSP组和药物对照组大鼠心肌细胞凋亡率低于低GSP组、中GSP组(P<0.05)。详见图3、图4。

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡情况

图4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较

2.4 各组大鼠心肌组织中TLR4及NF-κB蛋白表达比较

AMI组TLR4及NF-κB蛋白表达高于假手术组(P<0.05),与AMI组比较,低GSP组、中GSP组、高GSP组和药物对照组TLR4及NF-κB蛋白表达均降低(P<0.05),且与低GSP组、中GSP组比较,高GSP组和药物对照组大鼠心肌组织中TLR4及NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.05)。详见表3、图5、图6。

图5 各组大鼠心肌组织中TLR4蛋白表达条带图

图6 各组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达条带图

表3 各组大鼠心肌组织中TLR4及NF-κB蛋白表达比较

2.5 qRT-PCR检测各组心肌组织TLR4及NF-κB mRNA相对表达

AMI组TLR4及NF-κB mRNA高于假手术组(P<0.05),与AMI组比较,低GSP组、中GSP组、高GSP组和药物对照组TLR4及NF-κB mRNA相对表达均降低(P<0.05),且与低GSP组、中GSP组比较,高GSP组和药物对照组大鼠心肌组织中TLR4及NF-κB mRNA表达明显降低(P<0.05)。详见表4。

表4 各组心肌组织TLR4及NF-κB mRNA表达比较

3 讨 论

AMI发病急骤,发病机制为冠状动脉阻塞导致血流阻断,引起心肌组织供血氧不足,加快心肌细胞凋亡。心肌梗死病人临床治疗多采用药物干预为主,他汀类药物具有抑制心肌梗死后心室重构、保护心室功能的作用。阿托伐他汀能够通过抑制甲氰戊酸通路活化降低对小分子G蛋白异戊二烯化修饰,有利于减少心肌细胞凋亡,改善心肌组织纤维化[8]。但是心肌梗死病人多数存在免疫功能低下,长时间服用他汀类药物会加大机体毒性作用。

TTC染色是检测心肌梗死大鼠梗死体积的主要方法,心肌梗死大鼠心肌组织会出现砖红色危险梗死区域及灰白色梗死区域,随着心肌梗死疾病加重而白色梗死区域增大[9]。心肌梗死缺血再灌注后中性粒细胞及血管内皮细胞表达增加后会释放大量的氧自由基等细胞毒性因子,细胞毒性因子可损伤血管内皮细胞及抑制血管扩张,加快细胞结构及功能损伤增加血管通透性而增加心肌组织水肿[10]。本研究结果表明,不同浓度的GSP均能够缩小心肌梗死体积,降低心肌组织含水量。GSP是在葡萄籽中提取的天然多酚类化合物,能够对炎症反应、氧化损伤导致的细胞凋亡发挥保护作用。在以往实验研究中GSP常被作为抗氧化剂,能够减少心肌缺血再灌注家兔氧化应激从而减轻心肌损伤[11]。GSP抗心肌梗死大鼠梗死免疫主要是通过抑制心肌损伤的心肌酶表达而减轻心肌组织损伤,缩小梗死体积,恢复血管通透性而减少细胞水肿。武报佳[12]研究证实,葡萄籽原花青素(GSPE)能够通过抑制多聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶1(PRAP-1)表达而缩小心肌梗死体积。

心肌梗死大鼠HE染色发现组织结构紊乱,TUNEL法检测发现大量心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡产生与钙离子及线粒体发生异常相关。研究证实,心肌梗死大鼠心肌组织存在氧化损伤,产生大量超氧负离子而增加细胞色素合成及释放,能够激活Caspase等信号通路而增加p53过表达启动细胞凋亡程序[13-14]。GSP主要活性成分之一儿茶素能够清除自由基,提高心肌细胞抗氧化能力,从而减少心肌细胞凋亡。戴顺妮等[15]研究证实GSP活性物质儿茶酸能够通过增加DNA修复酶表达而减少体外实验心肌细胞凋亡。本研究证实,GSP对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用并呈现浓度依赖性,作用机制与抑制TLR4及NF-κB表达相关。

TLR4是一类天然免疫受体,是人类首个发现的TLR相关蛋白,当发生内源性损伤时可被特异性激活。体外实验表明,在心肌细胞中采用TLR4激动剂能够增加肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活性,加快心肌细胞凋亡[16-17]。TLR4信号能够通过两种不同途径加快心肌细胞凋亡,能够激活髓样分化因子88(MyD88)信号及非MyD88通路表达,配体与TLR4形成复合物后增加MyD88活性而介导TNF-α相关因子激活NF-κB增加心肌细胞凋亡[18-19]。以往研究表明,葡萄籽原花青素能够通过抑制PRAP-1活性而阻遏线粒体相关通路Caspase-3及Bax蛋白水平,进一步减少心肌损伤,抑制心肌细胞凋亡发挥保护心脏作用[20]。本研究证实,GSP能够通过抑制TLR4及NF-κB表达而减少心肌损伤,作用机制在于GSP活性成分儿茶酸能够通过减少NF-κB表达而抑制其活性,降低p53的磷酸化而改善细胞存活周期,促进心肌细胞存活。

综上所述,GSP能够显著缩小心肌梗死大鼠梗死体积,降低心肌组织含水量,抑制心肌细胞凋亡,呈现浓度依赖性,研究机制可能与抑制TLR4/NF-κB表达相关。