二氢槲皮素对心力衰竭大鼠心功能的保护作用及其作用机制

孙春梅,唐 玲,庹玉平

心力衰竭(heart failure,HF)是由心室充盈或射血功能受损引起的一种异质性综合征,是各种心脏病发展的终末期阶段,具有较高的发病率和死亡率,已成为严重影响人民健康的公共卫生问题[1-2]。尽管目前HF的研究和治疗取得了明显成效,但仍有部分病人因HF而功能受损、生活质量低下甚至过早死亡,临床治疗效果仍然有限[3]。研究发现,HF发病主要与体内细胞因子系统激活、心肌细胞过度凋亡等有关[4]。因此,开发针对HF发病机制相关的新治疗方法对HF的临床治疗具有重要意义。二氢槲皮素(quercetin,DHQ)是松科植物黄杉、雪松等常见的典型黄酮类成分,具有一系列生物活性,包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤和血管舒张等[5]。DHQ可通过抑制氧化应激、调节内质网应激以及线粒体凋亡途径保护心肌缺血再灌注损伤、预防糖尿病性心肌病,还可通过减轻线粒体功能障碍和糖代谢紊乱改善心肌细胞肥大,其对压力超负荷后的心肌肥厚和心肌纤维化也有一定改善作用[6-9]。DHQ对心肌损伤具有一定治疗作用,但DHQ在HF方面的报道较少,且DHQ在心血管保护方面的作用机制尚未完全明确。因此,本研究探究DHQ对HF大鼠心功能的影响,并分析其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

无特定病原体(SPF)级雄性健康Wistar大鼠60只,6～8周龄。常规饲养在室温18～24 ℃、相对湿度50%～70%、通风的动物室内,标准饲料喂养,自由饮水、进食。盐酸阿霉素(规格:每袋100 g)购自江苏达捷生物科技有限公司;DHQ(纯度>98%,规格:0.25 g)购自江苏艾康生物医药研发有限公司;卡托普利(规格:每片25 mg,国药准字H32023731)购自常州制药厂有限公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒、增强化学发光试剂(enhanced chemiluminescence,ECL)均购自上海碧云天公司;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购自上海邦景实业有限公司;脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、C反应蛋白(C-reactive pmtein,CRP)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自武汉赛培生物科技有限公司;兔抗B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(B-cell-lymphoma-2 related protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme-3,Cleaved Caspase-3)、高迁移率族蛋白1(high mobility group protein1,HMGB1)、酪氨酸激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、磷酸化JAK2(p-JAK2)、信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)抗体,鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体均购自美国Abcam公司;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔、山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验模型制备

随机选取15只大鼠,采用腹腔注射盐酸阿霉素法造模,按1.25 mg/kg的剂量进行腹腔注射,每周2次,连续6周,累积注射15 mg/kg,观察大鼠行为学改变(体质量减轻、活动量减少、精神不振、毛色黯淡无光等),于第16 天清晨采用心脏超声检测左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF),LVEF低于40%即表示HF模型建立成功。

1.2.2 实验分组及给药处理

将造模成功的45只大鼠随机分为模型组(HF组)、DHQ低剂量组(L-DHQ组)、DHQ高剂量组(H-DHQ组)、卡托普利组(Captopril组),每组15只。另取15只健康大鼠设为对照组(NC组)。其中L-DHQ组大鼠灌胃DHQ溶液(0.4%羧甲基纤维素钠配制)15 mg/kg;H-DHQ组大鼠灌胃DHQ溶液60 mg/kg;Captopril组大鼠灌胃卡托普利10 mg/kg;HF组和NC组大鼠灌胃同等剂量的0.4%羧甲基纤维素钠溶液。每天灌胃1次,连续给药14 d。

1.2.3 心功能指标检测

大鼠末次给药结束后,禁食不禁水12 h,以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,采用彩色超声仪检测大鼠LVEF、左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、每搏心输出量(stroke volume,SV),连续检测3个连续心动周期,每个指标均取3次平均值。

1.2.4 采集样本

超声检测结束后,经大鼠腹主动脉采血,静置1 h,3 000 r/min离心10 min,收集血清,于-20 ℃保存。采血后立即处死大鼠,剪开胸腔快速取出心脏,以预冷的生理盐水冲洗心脏,滤纸吸去多余水分,留取左室心肌组织,一部分心肌组织置于4%多聚甲醛固定,一部分心肌组织于-80 ℃保存备用。

1.2.5 HE染色观察大鼠心肌组织病理变化

取4%多聚甲醛中的心肌组织,常规石蜡包埋切片,厚度为4 μm,取切片按HE试剂盒说明书进行HE染色、中性树胶封片,光学显微镜下观察。

1.2.6 TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡情况

取大鼠心肌组织石蜡切片,常规脱蜡水化后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,37 ℃下加入蛋白酶K溶液消化20 min,PBS冲洗,在4 ℃下孵育4 min,加入3%过氧化氢孵育10 min,PBS冲洗,加入TUNEL反应液于37 ℃下孵育60 min,洗涤后抗荧光素抗体孵育30 min,用二氨基联苯胺(DAB)染色,随后用苏木精复染3 min,乙醇浸泡2 s,自来水冲洗,晾干后中性树胶封片,光学显微镜下观察心肌细胞凋亡情况,凋亡阳性细胞呈深棕黄色。细胞凋亡率(%)=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.7 ELISA法检测大鼠血清中BNP、炎性因子和氧化应激指标水平

取大鼠血清,按照ELISA试剂盒说明书检测血清BNP、IL-6、TNF-α、CRP、SOD、GSH-Px、MDA水平,采用酶标仪检测待测标本吸光度(OD)值,绘制标准品回归曲线,以OD值计算待测标本浓度水平。

1.2.8 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测大鼠心肌组织相关蛋白表达

取大鼠心肌组织,加入预冷的裂解液,提取组织蛋白,以BCA法测定蛋白质量浓度,将蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,加入5%脱脂牛奶,37 ℃条件下封闭1 h,洗膜,分别加入Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、Cleaved Caspase-3(1∶800)、HMGB1(1∶1 000)、JAK2(1∶1 000)、p-JAK2(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗体,4 ℃孵育过夜,洗膜,加入对应HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG抗体(1∶2 000),37 ℃孵育2 h,洗膜,加入ECL发光液,于暗室内曝光、显影,采用凝胶成像分析系统拍照分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组心功能指标比较

与NC组比较,HF组大鼠心功能指标LVEF、LVFS、SV均明显降低,BNP水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与HF组比较,L-DHQ组、H-DHQ组和Captopril组大鼠心功能指标LVEF、LVFS、SV均明显升高,BNP水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),且H-DHQ组和Captopril组大鼠心功能指标LVEF、LVFS、SV均明显高于L-DHQ组,BNP水平明显低于L-DHQ组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组心功能指标比较

2.2 各组大鼠心肌组织病理变化

NC组大鼠心肌细胞排列整齐、紧密,结构清晰,无明显变性、坏死;HF组大鼠心肌细胞排列紊乱,大量细胞变性、坏死,胞质呈溶解状态,肌纤维明显肿胀、断裂,间质明显充血水肿,伴大量炎性细胞浸润;L-DHQ组、H-DHQ组和Captopril组大鼠心肌细胞变性、坏死程度明显减少,间质水肿、炎性细胞浸润均得到不同程度改善,且H-DHQ组和Captopril组大鼠心肌组织病理损伤改善更为明显。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化(HE染色,×400)

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡及凋亡蛋白表达比较

与NC组比较,HF组大鼠心肌细胞凋亡率、心肌组织中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达量均明显升高,Bcl-2蛋白表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与HF组比较,L-DHQ组、H-DHQ组和Captopril组大鼠心肌细胞凋亡率、心肌组织中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达量均明显降低,Bcl-2蛋白表达量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且H-DHQ组和Captopril组大鼠心肌细胞凋亡率、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达量均明显低于L-DHQ组,Bcl-2蛋白表达量明显高于L-DHQ组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图2～图5。

图2 光学显微镜下观察各组心肌细胞凋亡情况(TUNEL染色,×200)

图3 各组心肌细胞凋亡率比较

图4 各组心肌细胞凋亡蛋白表达条带图

图5 各组心肌细胞凋亡蛋白表达比较

2.4 各组大鼠血清炎性因子水平比较

与NC组比较,HF组大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平均明显升高(P<0.05);与HF组比较,L-DHQ组、H-DHQ组和Captopril组大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平均明显降低(P<0.05),且H-DHQ组和Captopril组大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平明显低于L-DHQ组(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血清炎性因子水平比较

2.5 各组大鼠血清氧化应激指标水平比较

与NC组比较,HF组大鼠血清SOD、GSH-Px水平均明显降低,MDA水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与HF组比较,L-DHQ组、H-DHQ组和Captopril组大鼠血清SOD、GSH-Px水平均明显升高,MDA水平明显降低,且H-DHQ组和Captopril组大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平改善程度明显优于L-DHQ组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清氧化应激指标水平比较

2.6 各组大鼠心肌组织中HMGB1蛋白、JAK2/STAT3通路相关蛋白表达比较

与NC组比较,HF组大鼠心肌组织中HMGB1蛋白表达量、p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值均明显升高(P<0.05);与HF组比较,L-DHQ组、H-DHQ组和Captopril组大鼠心肌组织中HMGB1蛋白表达量、p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值均明显升高(P<0.05),且H-DHQ组和Captopril组大鼠心肌组织中HMGB1蛋白表达量、p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值均明显高于L-DHQ组(P<0.05)。详见图6、图7。

图6 各组心肌组织中HMGB1蛋白、JAK2/STAT3通路相关蛋白表达的条带图

图7 各组心肌组织中HMGB1蛋白、JAK2/STAT3通路相关蛋白表达比较

3 讨 论

HF可以由几乎所有的心血管疾病发展而来,临床常见的病因有心肌梗死、高血压、心肌病等。随着对HF研究的深入,发现HF发生时心脏会出现一系列进行性病理变化,加重心肌损伤,进而导致心功能下降发生致死性HF[10-11]。DHQ因在炎症、微生物感染、肿瘤、肝脏等疾病中显示的药理活性而受到特别关注[12]。有研究报道,DHQ还具有预防与治疗心脑血管疾病的药理作用[13]。本研究建立HF大鼠模型,分析DHQ对HF的作用机制。LVEF、LVFS、SV均是心脏超声心动图指标,可直观反映心脏功能[14]。BNP主要储存于心室肌内,具有扩张血管调节血压动态平衡、促进水钠排出以预防水钠潴留的作用,HF发生时心室负荷增加,心肌细胞受到机械牵拉后刺激心室肌细胞大量分泌BNP。因此,BNP水平升高程度与HF严重程度呈正相关,是心室功能障碍的特异性指标[15]。本研究发现,DHQ可明显改善HF大鼠LVEF、LVFS、SV、BNP水平,保护HF大鼠心功能。此外,HE染色结果显示,高剂量DHQ对HF大鼠心肌组织病理损伤的改善效果与阳性药物卡托普利的作用效果相当,提示DHQ具有明显保护HF心功能的效果。

细胞凋亡在许多生理病理过程中起着至关重要的作用,逐渐但持续的心肌细胞凋亡是HF发生、进展的主要原因,抗细胞凋亡干预是HF的有效治疗途径之一[16]。心肌细胞凋亡过程中,Bcl-2家族和Caspase家族起重要作用。Bcl-2家族有两个代表性成员:促进凋亡基因的Bax和抑制凋亡基因的Bcl-2,Bcl-2的过度表达可以阻断细胞凋亡,保护心肌细胞,而Bax的作用正好相反。Caspase-3则是Caspase家族中最重要的成员,是控制心肌细胞凋亡发生、发展的标志酶[17]。Chen等[18]报道,DHQ通过调控Bcl-2、Bax和pro-Caspase-3蛋白表达抑制肝细胞凋亡。本研究检测HF大鼠心肌细胞凋亡和凋亡蛋白表达,结果显示,HF大鼠心肌细胞凋亡率明显升高,心肌组织中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调。DHQ则可明显降低HF大鼠心肌细胞凋亡率,并下调心肌组织中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达,且DHQ剂量越大其作用效果越强。表明DHQ可通过调控凋亡蛋白表达抑制HF大鼠心肌细胞凋亡。

氧化应激和炎症反应是HF发生、发展的重要机制。HF发生时缺血、缺氧状态会引起氧化代谢异常,形成氧化应激状态,而氧化应激会引起炎症反应,促进炎症细胞因子CRP、TNF-α、IL-6等大量分泌产生,加重心肌组织损伤,从而导致HF的进展。因此,氧化应激敏感性指标(如SOD、GSH-Px、MDA)和炎症标志物可预测HF病人的预后[19-20]。本研究结果显示,DHQ能够明显降低HF大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平和MDA含量,增高HF大鼠血清SOD、GSH-Px活性,且高剂量DHQ效果明显优于低剂量DHQ,与卡托普利作用效果比较无明显差异。表明DHQ可明显减轻HF大鼠炎症反应和氧化应激状态。

HMGB1是一种存在于真核细胞细胞核中的染色体蛋白。研究发现,单核细胞在HMGB1的刺激下可诱导TNF-α、IL-6等多种促炎细胞因子释放,其在炎症反应的发生、启动中起到了关键作用,可作为炎症性疾病的治疗靶点[21]。Volz等[22]研究发现,HMGB1是HF病人死亡的独立预测因子。Taskin等[23]研究表明,沉默HMGB1表达可抑制阿霉素的心脏毒性。提示HMGB1可能是HF治疗的有效靶点。JAK/STAT信号通路作为一个进化保守的信号转导通路,参与多种细胞过程,如炎症、凋亡、细胞周期调控等[24]。研究表明,JAK2/STAT3通路的激活已被确定为心肌炎症相关的内在转导途径[25]。本研究检测HMGB1蛋白和JAK2/STAT3通路蛋白表达发现,HF大鼠心肌组织中HMGB1蛋白表达量、p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值均明显升高,提示HMGB1蛋白表达改变及JAK2/STAT3通路激活参与HF大鼠心肌病理损伤的发生、发展。而经过DHQ干预后,HF大鼠心肌组织中HMGB1蛋白表达量、p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值则明显降低,且高剂量DHQ的干预效果明显优于低剂量DHQ,与卡托普利疗效相当。该结果提示DHQ通过抑制HMGB1表达和JAK2/STAT3信号通路活化减轻HF大鼠心肌损伤。

综上所述,DHQ可通过减轻炎症反应、氧化应激和抑制细胞凋亡保护HF大鼠心功能,其保护作用与抑制HMGB1表达和抑制JAK2/STAT3信号通路活化有关。本研究证实DHQ对于治疗HF具有潜在价值,可作为HF治疗的候选药物。

志谢:川北医学院药学院陈阳老师在本实验研究中提供的帮助与指导。