前沿科研成果融入药物分析课程教学实践*

汪 熙，吴 娟，周 凯

(1 常州工业职业技术学院材料工程学院，江苏 常州 213164；2 江苏理工学院化工与环境学院，江苏 常州 213164)

近年来，用于治疗或诊断的多肽、蛋白质、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等药物不断出现，国外已批准上市的生物技术药物产品约100多种，进入临床实验的生物技术药品达400种，并逐年显著增加[1-3]。白介素-2(Interleukin-2，IL-2)是细胞因子大家族中的重要一员，它是由多种免疫细胞产生的一类调节性蛋白，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中发挥重要作用[4]。IL-2是首个被用于肿瘤免疫疗法的药物，美国FDA基于高剂量 IL-2在临床肿瘤免疫治疗中的显著疗效，分别于1992年和1998年批准白介素-2 (Aldesleukin)用于晚期肾癌和恶性黑色素瘤的治疗。然而，随着受众面的不断扩大，其在临床应用中存在的问题愈加凸显。一是不良反应较多。IL-2可引起发热、呕吐、低血压等一般症状，还可导致水、盐代谢紊乱等功能异常；最严重的是毛细血管渗漏综合征(Vascular leakage syndrome，VLS)，导致血管内液体积聚在肺和肝等器官中，随后引发肺水肿和肝细胞损伤，使患者不得不中止治疗。二是给药次数多、剂量大。由于IL-2在人体内半衰期较短，反复高频率的给药不仅加大了副作用，还降低了患者对治疗的依从性。这极大地限制了IL-2相关疗法的进一步临床应用[5-7]。为了解决这些问题，研究者们进行了多方面的尝试，蛋白药物的聚乙二醇修饰是其中最重要的化学修饰技术之一。聚乙二醇修饰又称PEG化，是将聚乙二醇聚合物连接到一些生物分子(比如肽，蛋白质和抗体片段)上的过程，旨在改善上述蛋白药物的问题，为此诞生了一系列聚乙二醇衍生物[8-10]。在聚乙二醇修饰白介素-2长效化药物的开发过程中涉及到药物分析课程中蛋白质类药物分析这一章节中的多个知识点。

药物分析是是一门研究和发展药品质量控制方法的实践应用性学科，该课程的教学目标旨在使学生掌握常见药物及其制剂的成分鉴别、检查和含量测定的基本原理、分析方法、操作技能，能够正确理解和准确执行《中国药典》；熟悉药品检测与质量控制的一般指标及药品质量规范制定等，树立全面的药品质量观念；具有探索分析和解决药品质量问题的基本思路和能力，为以后从事药学及相关领域工作打下基础[11]。蛋白类药物分析是药物分析课程中的一个重要章节，学生对于本章内容的学习主要是通过蛋白药物的结构与功能关系等理论知识和离心、浓缩等基础实验的学习来了解和掌握常见蛋白类药物的检验分析方法。然而，理论知识的学习通常较为枯燥，部分专业术语艰涩难懂，同时仅仅开展基础性实验使得学生的认知和实操能力无法满足当前日新月异的医药产业和企业发展的需求。这就导致学生接触的课本知识和前沿的科研成果之间存在着一条难以逾越的鸿沟。

表1 目前已上市蛋白类生物药物[2]Table 1 The protein biological drugs on the market at present

笔者曾从事生物新药的临床前研究，在科研工作中采用多种不同构型、分子量和种类的聚乙二醇对多种蛋白进行化学修饰，为新药开发提供候选药物分子。将蛋白新药开发的前沿技术引用至高校药物分析课程的教学，不仅能丰富学生对蛋白类药物的认识，同时可以在实验中加深学生对蛋白新药的检验和分析原理的理解，提高学生实验操作、表征及分析能力，为学生未来科学研究与工作实践奠定坚实基础。同时，充分体现和落实 “以科研促进教学”的理念。

1 实验目的

(1)通过选择特定结构、分子量的聚乙二醇对白介素-2蛋白进行随机修饰和考察修饰工艺条件，加深学生对“蛋白结构决定性质和功能”的理解，扩宽学生对于当前蛋白新药开发前沿技术认识的视野，了解长效化修饰技术在新药开发领域的应用。

(2)通过对不同工艺条件下修饰产物的定量、定性分析和纯化分离实验的开展，提高学生对生物药物中间体关键质量指标的鉴别分析能力和纯化分离的技能，同时培养学生自主的分析判断能力。

2 实验原理

PEG衍生物的活化官能团选择主要取决于蛋白表面游离的具有反应活性的基团类型。蛋白表面的反应性基团多呈亲核性，包括氨基、羧基、羟基等活性基团，其中以氨基修饰居多。白介素-2分子中含有11个可被PEG修饰的赖氨酸，不同数目的赖氨酸修饰会产生不同分子量大小的修饰产物。分子量越大，药物半衰期越长，但同时蛋白上的生理功能区域可能被掩盖越严重，导致体内外生物活性显著降低。因此，合理控制修饰反应条件，获得特定修饰度和分子量大小的PEG修饰产物，将为筛选得到具有一定临床前景的新药分子提供思路。

图1 PEG修饰rhIL-2的制备示意图Fig.1 Schematic diagram of preparation of PEG modified rhIL-2

3 实验仪器与试剂

3.1 实验试剂

重组人白介素-2(rhIL-2)，江苏理工学院实验室提供；甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)，北京键凯科技公司；PBS磷酸盐缓冲液(100 mM，pH 8.0)，实验室自制；N，N-亚甲基双丙烯酰胺，生工生物公司；十二烷基硫酸钠，麦克林公司；过硫酸铵，阿拉丁公司。

3.2 实验仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪，Agilent公司；AKTA Pure 25 蛋白纯化仪，GE医疗公司；DK-3506酶标仪，DECCA公司；低温离心机，湖南湘仪；FYL-YS-281L层析冷柜，北京福意联；DYCZ-26B电泳仪，北京天能。

4 实验步骤

4.1 蛋白浓缩和缓冲液置换

PEG修饰反应之前需要将rhIL-2置换至特定的修饰缓冲液中，并对其反应浓度进行定量。将一定质量的rhIL-2蛋白置于截留分子量为3 kD的超滤浓缩管中，4 ℃下进行离心和浓缩。置换至PBS缓冲液中后采用酶标仪对蛋白浓度进行准确定量，据此计算获得反应蛋白浓度。

4.2 蛋白修饰反应

向一定浓度的rhIL-2蛋白溶液中分别按照摩尔比为1∶10、1∶20、1∶30加入PEG粉末，用移液器缓慢反复吹打，原料混合均匀后置于层析冷柜中反应16 h。

4.3 蛋白纯化分离

采用离子交换层析法对修饰产物进行分离纯化，除去杂质。配制20 mM NaAc(pH 5.0)和20 mM NaAc+1 M NaCl(pH 5.0)缓冲液作为纯化平衡液和洗脱液。通过蛋白纯化柱平衡、上样、再平衡、梯度洗脱和产物收集等步骤获得目标修饰蛋白组份。

5 实验结果与分析

5.1 蛋白浓度测定分析

PEG修饰蛋白反应前需将rhIL-2蛋白置换至PBS磷酸盐缓冲液(100 mM，pH 8.0)中，并且要准确定量。这是由于氨基的pKa值决定的，在碱性下亲核反应才能得以顺利进行。同时，rhIL-2蛋白的浓度对修饰反应进行的快慢有较大影响。蛋白浓度高，PEG与活性基团接触和偶联的几率越大，越有可能发生反应和生成修饰度和分子量高的产物[12]。表2为不同超滤次数和离心转速下的蛋白浓度结果。表2结果表明：离心转速越高，超滤次数越多，越有利于获得高浓度的蛋白，而真正的rhIL-2蛋白药物生产过程中并非蛋白浓度越高越好，而是需要在多个影响因素下获得一个最优工艺条件，蛋白浓度过高相应反应产物中的杂质含量也可能越高，将会显著增加后续纯化分离的成本。通过对rhIL-2原蛋白的预处理和浓度测定能够使学生们深刻地认识到蛋白的化学修饰是需要在特定条件下才能进行的，凡事需要把握好一个平衡和度的问题，过犹不及，同时作为一个药学专业学生从事科研工作一定要严谨。通过这个科研活动也将思政元素巧妙地融入了教学中。这也是一个理论指导实践的鲜活案例。

表2 不同超滤次数和离心转速下的蛋白浓度Table 2 Protein concentration under different ultrafiltration times and centrifugal speed

5.2 蛋白修饰产物纯度分析

表3 不同反应条件下产物的含量Table 3 The content of products under different reaction conditions

蛋白质的一个重要性质是具有特定紫外吸收。这是因为蛋白质分子中含有芳香氨基酸残基，芳香氨基酸的R基含有苯环共轭π键系统。其中色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨都属于芳香氨基酸，它们具有紫外吸收特性，大多数蛋白质中都含有这3种氨基酸。因此，可以利用280 nm波长处的紫外吸收特性定量检测蛋白质的含量。2015版《中国药典》收录了高效液相色谱法测定重组人白介素-2的蛋白含量。由于PEG修饰后并不会显著影响rhIL-2的特定紫外吸收强度，因此该法也适用于修饰后rhIL-2产物的含量分析。表3给出的是通过高效液相色谱仪检测出来的在不同反应条件下修饰蛋白产物的含量和出峰时间。结果表明：在相同蛋白浓度和反应时间下，随着修饰反应比例的提高，产物的保留时间逐渐减小，更早出峰，分子量相应更大。同时，rhIL-2：PEG摩尔比为1∶20时，产物含量相对较高，而继续提高到1∶30时则不利于获得纯度高的产品。通过借助仪器来分析药物质量指标，使学生们从色谱峰的动态变化过程中直观地认识到反应条件的不同对修饰产物分子量和含量两个方面带来的显著差异。带着这种认识学生们能够更加深刻地理解高效液相色谱法测定蛋白含量的原理，一些原本晦涩难懂的专业术语，如：保留时间、峰面积、峰宽等也更容易掌握和运用。此外，通过这种科研活动显著提高了学生仪器操作的技能和对实验结果进行科学分析的素养，而这一点也是今后企业在招聘和培养人才时看重的主要能力。

5.3 蛋白纯化分离分析

图2 修饰产物的离子交换纯化图谱Fig.2 Ion exchange purification spectra of modified products

离子交换层析在分离纯化蛋白质的层析手段中使用最广泛，其分离原理是离子交换树脂结合带有大量电荷的侧链，当溶液pH偏离等电点时，蛋白质就会带电荷，若所带电荷与离子交换树脂侧链电荷相反，蛋白质就可与之结合，结合的蛋白质可根据结合力的不同用不同浓度的盐离子洗脱，从而达到分离纯化效果。采用离子交换层析分离PEG修饰蛋白质的最大优势在于PEG不带电荷保证了它不会吸附于柱上，因而可以很方便的将PEG与蛋白质分开[13]。图2为采用离子交换层析法纯化通过柱平衡、上样、再平衡、梯度洗脱的色谱图，从紫外吸收峰随洗脱梯度变化曲线上可以看出：当洗脱的盐浓度开始增加时，PEG修饰rhIL-2产物开始从离子交换介质上被逐步洗脱，相应的蛋白紫外吸收峰呈迅速上升趋势。而仅仅当盐浓度继续增加至20%时，产物紫外吸收电压值降低至检测限下，这表明蛋白修饰后的电荷和与介质之间的结合性质发现了显著变化。整体上从图谱上可以看到主产物峰只有一个且较为对称，基本能够将产品与杂质分离，从而验证了该实验所选择的层析方法和工艺条件是可行的。在蛋白类药物分析技术的教学中，学生理解蛋白质两性解离性质和学会运用这种特性开展纯化分离一直是一个难点。通过该科研活动使学生更加生动地理解蛋白质的两性性质和化学修饰对性质的影响，通过掌握理论并灵活运用来解决在蛋白类药物纯化分离分析中的实际问题，有效开拓学生的科研创新思维。

6 结 语

当前，社会科学技术日新月异，为适应新时代的发展和培养符合高质量发展要求的技能型人才，专业课教学应该与时俱进：教师不仅要教育学生脚踏实地地学习理论知识和实验技能，还应当适时“仰望星空”，主动关注制药领域最新研究进展和前沿技术成果，充分挖掘他们探索新专业技术领域的科研潜质。本文中展示的PEG修饰rhIL-2、分离纯化和质量分析不仅是科研项目中的完整过程，同时也是一个生动、新颖、有趣的教学案例。通过将当前长效化蛋白新药开发的前沿技术成果引入到课程教学中，可加深学生对理论知识的理解，丰富优化教学内容，使学生学好理论知识的同时懂得知识的不断创新，用理论提升对实验问题的认识。同时，还充分锻炼了学生仪器操作的技能和提升了其对实验结果进行科学分析的素养，这种能力和素养将会使他们在今后的发展中受益终生。