不同贮藏方法对桑白皮指标性成分影响研究

白 华 ，白 娟，周光姣 ，纪东汉 ，孙 敏

（1. 安徽中医药科学院 亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800；2. 亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800；3. 安徽省医学科学研究院，安徽 合肥 230061；4.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012）

桑白皮为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥根皮，始载于《神农本草经》[1]，具有利水消肿、宣肺平喘等作用[2]。现代药理研究发现桑白皮含有生物碱类、香豆素类等多种化学成分，具有降血糖、降血压、抗病毒等作用，其中桑根酮C 和DNJ（1-脱氧野尻霉素）应用最为广泛。笔者针对不同产地桑白皮展开实地调查，发现亳州药材市场上的桑白皮质量差异较大，较突出的原因是包装方法与贮藏时间不同，包装主要有蛇皮袋、聚乙烯包装袋和真空包装，其中真空包装相对较少；贮藏时间有三个月、半年、一年甚至两年以上的。因此对桑白皮贮藏方法进行研究，选择适宜的包装方法及贮藏时间尤为重要。故笔者收集了35 批桑白皮样品，以桑根酮C与DNJ 为指标进行含量的测定比较[3-4]，评价不同的包装方法及贮藏时间对桑白皮指标性成分的影响，优选出桑白皮的贮藏方法以提升桑白皮的质量，为桑白皮质量的科学评价与有效控制提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（安捷伦1260 型）、 电子分析天平（日本岛津，AU-2200 型）、数显恒温水浴锅（金坛市晶玻实验仪器厂，HH-S2 型）、离心机（金坛市晶玻实验仪器厂，800 型）、超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ-500E 型）、数显鼓风干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司）、高速粉碎机（武义海纳电器有限公司）、循环水式真空泵（郑州市巩义华玉仪器厂，SHZ-D 型）、硅胶板（青岛胜海精细硅胶化工有限公司，100×100 mm）。桑根酮C 对照品（中国食品药品检定研究院批号160330，含量测定用，纯度大于97%）、DNJ 对照品（成都普菲德生物技术有限公司批号160706）；甲醇分析纯、甲醇色谱纯、正丁醇、无水乙醇、乙腈、苯骈戊三酮（天津市大茂化学试剂厂）、三氯化铁、冰乙酸、甘氨酸（江苏强盛功能化学股份有限公司）、盐酸、芴甲氧羰酰氯、三氯甲烷（洛阳市化学试剂厂）、娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈有限公司，600 mL）。

1.2 药材

本次实验所使用的药材桑白皮全为一月末二月初分别在亳州（采集两批）、江苏、宿州、大别山实地采挖，经专家鉴定为桑科植物桑的干燥根皮。采挖后按照药典的方法进行处理干燥，同一样品分别采用蛇皮袋、聚乙烯包装袋、真空包装袋包装并在同一环境下常温分别贮藏3 个月、12 个月（采挖样品编号、贮藏时间、产地详见表 1）。

2 薄层色谱鉴别

2.1 桑根酮C定性鉴定

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取桑根酮C 对照品适量，加甲醇溶解制得浓度为0.1550 mg/mL 的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

样品按批粉碎，过四号筛，60 ℃ 干燥1 h 后备用。称样约1.0 g，精密称定，置平底烧瓶中，加入甲醇20 mL，精密称定，回流1 h，放冷之后称量，并且用甲醇补足重量，充分混匀后过滤，量取续滤液10 mL，浓缩至干，残渣用甲醇溶入2 mL 的容量瓶中摇匀即得[5-6]。

2.1.3 实验方法

吸取供试品溶液10 μL，对照液溶液5 μL，依据《中华人民共和国药典》2015 年版通则0502 薄层色谱法，分别点于同一硅胶G 板上，以三氯甲烷∶甲醇（5∶1）为展开剂，展开、取出、晾干，加热吹干至显色[7]。

2.1.4 结果

对照品与桑白皮供试品色谱在相似的位置显现出相同蓝紫色斑点，斑点明显，结果易分辨。见图1。

图1 桑根酮C薄层色谱图

2.2 DNJ定性鉴定

2.2.1 定性对照品溶液的制备精密称取DNJ 对照品适量，加甲醇溶解制得浓度为0.7801 mg/mL 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

样品按批粉碎，过四号筛， 60 ℃ 干燥1 h 后备用。称样约1.5 g，精密称定，置15 mL 离心管中，并加入0.05 mol/L 的盐酸溶液10 mL，涡旋混合30 min，4000 r/min 转离心10 min，取上清液，再将残渣重复提取1 次，合并2 次提取液，浓缩至干，残渣用甲醇溶入2 mL 的容量瓶中摇匀即得[8]。

2.2.3 实验方法

吸取供试品溶液10 μL，对照液溶液5 μL，依据《中华人民共和国药典》2015 年版通则0502 薄层色谱法，分别点于同一硅胶G 板上，以正丁醇∶冰乙酸∶水 （5∶3∶1）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以0.2%的茚三酮溶液后略加热吹干至显色[9]。

2.2.4 结果

对照品与桑白皮供试品色谱在相似的位置显现出相同黄色斑点，斑点明显，结果易分辨，见图2。

图2 DNJ薄层色谱图

3 高效液相色谱研究

3.1 桑根酮C含量测定

3.1.1 色谱条件

色谱柱：岛津C18 色谱柱（250*4.6 mm，5020-39033）；以甲醇∶水（75∶25）为流动相；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃。在此色谱条件下进样10 μL 测定，色谱图见图3。

图3 桑根酮 C对照品及桑白皮样品 HPLC 图

3.1.2 对照品溶液的制备

同桑根酮C 定性鉴定“2.1.1”项下对照品溶液的制备方法制备。

3.1.3 供试品溶液的制备

同桑根酮C 定性鉴定“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备。

3.1.4 线性关系考察

分别精密吸取桑根酮C 对照品溶液 1、5、10、15、20、25 μL 依次进样，根据“3.1.1”的色谱条件进行测定，记录峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程为： Y=3698.6X+1724.1（r=0.9991），结果表明桑根酮 C 在0.1550～3.875 μg 范围内有良好的线性关系。

3.1.5 精密度试验

精密吸取上述桑根酮C 对照品溶液10 μL，根据“3.1.1”的色谱条件测定，重复测定6 次，记录峰面积，结果 RSD 为0.13%，表明本法精密度良好。

3.1.6 稳定性试验

取真空包装贮藏3 个月的亳州1 样品，制备供试品溶液，根据“3.1.1”的色谱条件，分别在0、4、8、12、16、20 h 进样10 μL，测定其峰面积，结果RSD 为1.11%，表明供试品溶液在20 h 内稳定性比较良好。

3.1.7 重复性实验

取真空包装贮藏3 个月的亳州1 样品6 份，分别制备供试品溶液，根据“3.1.1”的色谱条件，测定样品中桑根酮 C 含量，结果RSD 为1.67%。

3.1.8 加样回收实验

精密称取真空包装贮藏3 个月的亳州1 样品（桑根酮 C 含量为0.1913%）6 份，分别精密加入0.1550 mg/mL 的桑根酮C 对照品溶液6.0 mL，按“2.1.2”项下方法制备样品溶液，依次测定含量，计算桑根酮 C 回收率，结果见表2。

表2 桑根酮C 加样回收试验结果（n=6）

3.1.9 样品含量测定

取35 批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液， 在“3.1.1”色谱条件下测定样品中桑根酮 C的含量，结果见表3。

表3 样品中桑根酮C 的含量（n=35）

3.2 DNJ含量测定

3.2.1 色谱条件

色谱柱：岛津C18 色谱柱（250*4.6 mm，5020-39033）；以乙腈∶0.1%冰醋酸水溶液（55∶45）为流动相；流速：1.0 mL/min； 检测波长：265 nm；柱温：30 ℃。

3.2.2 对照品溶液的制备

同DNJ 定性鉴定“2.2.1”项下对照品溶液的制备方法制备。

3.2.3 供试品溶液的制备

同DNJ 定性鉴定“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备。

3.2.4 柱前衍生化处理

精密吸取各药材供试品溶液和对照品溶液 2 mL置于20 mL 容量瓶中，依次加入 5 mL pH 为8.4 的硼酸盐缓冲液、5 mL 10 mmol/L FMOC-CL 的乙腈溶液，立即混匀，在25 ℃恒温水浴箱中反应 20 min，加入1 mol/L 甘氨酸2 mL 中和其余的衍生化试剂FMOC-CL，再加入 0.1% 的冰醋酸水溶液，定容至20 mL，混匀，用0.45 μm 菁头过滤器过滤，取续滤液，即得各药材供试品溶液和对照品溶液。取0.05 mol/L 的盐酸溶液2 mL，依上法制备空白供试液[10-15]。 精密吸取衍生化后空白供试液、对照品溶液及桑白皮样品溶液10 μL 测定，色谱图见图4。

图4 空白对照品、衍生化对照品及桑白皮样品 HPLC 图

3.2.5 线性关系考察

分别精密吸取上述DNJ 对照品溶液 1、5、10、15、20、25 μL，根据“3.2.4”的方法衍生化，依次进行测定，记录峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程为： Y=85.202X+51.521（r=0.9993），结果表明DNJ在0.7801 ～19.5025 μg 范围内有良好的线性关系。

3.2.6 精密度实验

精密吸取衍生化后的DNJ 对照品溶液10 μL，根据“3.2.1”的色谱条件测定，重复测定6 次，记录峰面积，结果 RSD 为0.32%，表明本法精密度良好。

3.2.7 稳定性实验

取真空包装贮藏12 个月的亳州1 样品，制备供试品溶液并衍生化处理，根据“3.2.1”的色谱条件，分别在0、4、8、12、16、20 h 进样10 μL，测定其峰面积，结果RSD 为1.87%，表明供试品溶液在20 h 内稳定性良好。

3.2.8 重复性实验

取真空包装贮藏12 个月的亳州1 样品6 份，分别制备供试品溶液并衍生化处理，根据“3.2.1”的色谱条件，测定样品中DNJ 含量，结果RSD 为1.53%。

3.2.9 加样回收实验

精密称取真空包装贮藏12 个月的亳州1 样品（DNJ 含量为0.0822%）6 份，分别精密加入0.7801 mg/mL 的DNJ 对照品溶液1.0 mL，制备供试品溶液并衍生化处理，依次测定含量，计算DNJ 回收率，结果见表4。

表4 DNJ 加样回收试验结果（n=6）

3.2.10 样品含量测定

取35 批样品，根据“3.2.3”“3.2.4”的方法制备供试品溶液并衍生化处理，分别吸取 10 μL，测定样品中的DNJ 含量，结果见表5。（n=35）

表5 样品中DNJ 的含量（n=35）

4 讨论

（1）在薄层色谱鉴别中，通过对比各种展开剂发现，分别以三氯甲烷∶甲醇（5∶1）为展开剂，以水：冰乙酸：正丁醇∶冰乙酸∶水（5∶3∶1）作为展开剂时，桑根酮C 与DNJ 的定性鉴别展开结果与显色结果佳，且斑点清晰易辨别。

（2）采用HPLC 测定桑根酮C、DNJ 含量时，经比较试验发现，分别以甲醇∶水（75∶25）为流动相、波长为280 nm；以乙腈∶0.1%冰醋酸水溶液（55∶45） 为流动相、波长为265 nm 的色谱条件下，系统分离效果最好，重复性较好，结果稳定。

（3）本实验研究发现各包装方法中真空包装优于聚乙烯包装优于蛇皮袋包装，在贮藏时间方面，总体上新鲜的桑白皮指标性成分含量最高，贮藏三个月的桑白皮的指标性成分桑根酮C 的含量较贮藏一年的为高，但也有个别情况如宿州的桑白皮真空贮藏一年后桑根酮C 的含量高于三个月的含量，可能是在包装过程中包装方法的严密性差异而出现这种情况；指标性成分DNJ 的含量贮藏三个月与贮藏一年比较，差异不明显。

通过对不同包装方法及及贮藏时间的桑白皮药材的有效成分含量的测定与分析可以看出，不同包装方法及及贮藏时间对药材的有效成分含量均有影响。不当的贮藏方法会降低有效成分的含量，从而影响桑白皮的临床疗效。

结合实验研究结果，新鲜的桑白皮药材如需贮备建议采用真空包装，贮藏时间不宜过长，一般3个月左右，最长不宜超12 个月。因真空包装贮藏成本较高，可在此基础上探索新的贮存方法，既能节约成本，又能保障临床疗效，为商家和用户带来最大便利。另桑白皮药材质量跟产地也有一定的关系，实验发现，亳州本地的桑白皮指标性成分含量高于江苏与宿州等地，体现了亳桑皮作为亳州道地药材的优势。