刺五加注射液对模拟失重大鼠心血管功能调节作用研究

朱元兵，徐 冲，范全春，武晓瑞，赵 爽，陈 超，卢卫红，刘军莲*

（1. 哈尔滨工业大学化工与化学学院，黑龙江 哈尔滨 150000；2. 中国航天员科研训练中心，北京 100094）

随着我国载人航天事业的不断发展，建立空间站的步伐越来越近，在太空停留的人员数量和时间会逐渐增加，太空恶劣的环境尤其是失重，会对心血管功能和结构造成负面影响[1]。失重会引起液体向头部移动，诱发机体心脏体积、重量和功能等异常，航天员在长期任务中，心脏输出量的增加，全身血管阻力显著降低，而返回地球通常会立位耐力不良，并可能发生心肌萎缩[2]。事实上，NASA 的证据报告已经描述了在着陆后左心室重量减少持续超过 3 天的现象[3]。此外，尾悬吊 21 d 模拟失重的大鼠心室重量减少，模拟失重 8 周的大鼠心肌细胞体积减少 23%[4]，这种动物失重模型的心脏和泵血功能降低可能与立位耐力不良有关。我们在前期研究模拟失重大鼠心肌组织蛋白质组学的基础上，发现钙调神经磷酸酶（Calcineurin, CaN）在模拟失重大鼠心肌中的表达发生变化，CaN 在心肌和骨骼肌慢纤维中特异表达，它不仅是 Z 线组成的结构蛋白，而且在信号转导和调节酶活性中也具有重要作用，因此该蛋白表达量变化，直接影响了心肌的收缩力[5]。刺五加（Acanthopanax senticosus(Rupr. Maxim.) Harms）含皂苷、黄酮等药理成分，早期有刺五加用于针对失重大鼠骨流失[6]以及血脂、血糖和免疫功能的报道[7]。刺五加还可扩张血管、增加冠脉血流量，缓解冠脉痉挛，改善缺血心肌代谢，增加组织对缺血缺氧的耐受性；此外，还能降低血液粘度、活血化瘀，疏通冠脉瘀阻，缓解心绞痛[8]。其扩张血管、增加血流量、改善脑循环、降低组织耗氧量的作用优于丹参，对缺血再灌注心肌能产生适应性保护作用[9]。然而，鲜有对失重心血管的保护作用研究。因此，本课题旨在对模拟失重大鼠心血管功能进行分析及刺五加注射液（Acanthopanax senticosusinjection, ASI）在 CaN 相关信号通路 Ca2+/CaN/NFAT3 的干预机理进行研究。

1 材料与方法

1.1 动物及模拟失重

SPF 级 6 周龄的 SD 雄性大鼠 50 只，体重 180 g 左右，购自北京维通利华动物实验动物技术有限公司，在 SPF 级动物室中适应饲养 1 周后，按体重配对原则随机分为空白组（k）、悬吊组（m），ASI 大剂量（g）、中剂量组（z）和小剂量组（x），每组 10 只。模拟中长期失重采取尾部悬吊 4 周法[10]，在悬吊 4 周后进行心脏超声，戊巴比妥钠麻醉，心脏取血，后断头处死，取心脏，称重。取左心室游离壁组织约 100 mg，于液氮中速冻10 min 后置于 -80℃ 冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂及仪器

试剂：S1063S 钙含量显色检测试剂盒（Beyotime）；Trizol（Invitrogen 公司）；TRANScript RT Kit 逆转录试剂盒（天根公司）；CAN（cell signaling）、NFAT3（cell signaling）、P-NFAT3（cell signaling）、β-actin（cell signaling）；qPCR 试剂盒：FAST qPCR Kit Master Mix (2 ×) Universal（KR0319, KAPA SYBR®）

仪器：Beckman Allgre 21R 高速冷冻离心机（Beckman 公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）；电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）；BioSens SC810B 凝胶成像仪（上海山富科学仪器有限公司）；NAS-99 分光光度计（ACTGene 公司）；ABI 7900HT 实时定量 PCR 仪（ABI 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 心脏指数

心脏指数是心脏重量与体重的比值。

1.3.2 心脏超声

采用 vevo2100 的动物心脏超声仪，MS250 探头进行超声检查。将大鼠麻醉，固定在超声实验台上，分别在胸骨旁短轴切面和胸骨旁长轴切面进行测量。

1.3.3 心肌酶谱

取大鼠血清，上样于美国贝克曼 TBA120 全自动生化分析仪，分析心肌酶谱，检测的指标有乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、α-羟丁酸脱氢酶（HBMB）。

1.3.4 钙离子浓度

取大鼠血清，利用钙含量显色检测试剂盒测样本中的 Ca2+含量。

1.3.5 qPCR 检测

a. 引物设计合成

根据基因名称等信息到 Genebank 中查找到相应序列，使用 Primer 5 软件设计扩增引物并合成。具体序列见表1：

Table 1 Primer sequence of mRNA related to rat myocardial tissue after four weeks of simulated weightlessness表1 模拟失重四周大鼠心肌组织相关 mRNA 的引物序列

b. RNA 提取和质检（见表2）

c. 逆转录 mRNA 反转录体系（见表3）

Table 3 Reverse transcription mRNA reverse transcription system表3 逆转录 mRNA 反转录体系

d. real-time PCR SYBR Green Ⅰ PCR 体系（见表4）

Table 4 Real-time PCR SYBR Green Ⅰ PCR system表4 Real-time PCR SYBR Green Ⅰ PCR 体系

e. PCR 程序（见表5）

1.3.6 蛋白质提取及 Western blot 实验

提取大鼠心肌组织总蛋白，蛋白浓度采用 BCA 法测定。SDS-PAGE 凝胶电泳，370 mA 转膜 1 h，封闭 1 h，孵育 1 抗。具体材料及使用稀释比例如下：CAN（CST, 1∶1 000）、NFAT3（CST, 1∶1 000）、P-NFAT3（CST, 1∶1 000）、β-actin（CST, 1∶1 000）。4℃ 孵育过夜，PBST洗膜 6 次，每次 5 min。室温孵育相应的 2 抗 2 h。ECL 发光液发光，利用 Quantity One 软件分析条带灰度。

1.3.7 统计学处理

采用 SPSS 20.0 统计软件进行数据处理，以（x̅±s）表示。多组之间的比较采用单因素方差分析（One way-ANOVA），进一步采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 模拟失重四周对大鼠体重、心脏指数及心脏动态超声的影响及刺五加注射液的干预作用

如表5 所示，模拟失重四周大鼠体重明显下降，但无统计学意义；ASI 对模拟失重导致的体重下降可能没有明显的改善作用，从统计结果发现，ASI 组间存在剂量依赖性，以小剂量组体重较好。心脏指数是心脏重量与体重的比值，在一定程度上反映心功能的变化，结果发现，模拟失重组与空白组未发现明显变化，但是刺五加大中小三个剂量组的心脏指数明显增高，且存在剂量相关性，以高剂量增加最明显。模型组大鼠心率较空白组显著升高（P<0.05），ASI 各个剂量组都不同程度能减慢心率，其中以中剂量组较明显，但无统计学意义。

模拟失重四周大鼠心脏短轴超声结果发现，模型组左室前壁舒张末期厚度（LVAW; d）、左室前壁收缩末期厚度（LVAW; s）、左室舒张末期内径（LVID; d）、左室收缩末期内径（LVID;s）、左室后壁舒张末期厚度（LVPW; d）和左室后壁收缩末期厚度（LVPW; s）较空白组均有减小趋势，其中 LVAW; s 减小较显著（P＜0.05）。对比模型ASI 小剂量组对 LVAW; d 和LVID;s 显著增加，高剂量组显著增加 LVID; d（P＜0.05）。模拟失重四周大鼠心脏长轴超声结果发现，模型组大鼠左室舒张末期室间隔厚度（IVS; d）、左室收缩末期室间隔厚度（IVS; s）、左室舒张末期内径（LVID; d）、左室收缩末期内径（LVID; s）、左室后壁舒张末期厚度（LVPW; d）和左室后壁收缩末期厚度（LVPW; s）较空白组均减小，但仅 LVID; s 减小显著，其余不显著。高剂量 ASI 相比于失重模型，显著提高了长轴 LVID; d 指标（P＜0.05），中小剂量组在心脏长轴参数的改善作用不明显。

模型组大鼠短轴和长轴的左室射血分数（EF）和左室缩短率（FS）均有升高趋势但不显著，其中 ASI 小剂量组升高较模型组更显著（P＜0.05）。模型组大鼠短轴和长轴的每搏量较空白组减少，其中 ASI 小剂量组大鼠心脏短轴的每搏量增加明显（P＜0.01），长轴每搏量也增加但无统计学意义。模型组大鼠短轴和长轴的心排量较空白组均有降低，其中ASI 小剂量组大鼠心脏短轴的心排量增加明显（P＜0.05）。

2.2 模拟失重四周对大鼠心肌酶谱变化影响及刺五加注射液的干预作用

模拟失重四周，检测大鼠血清中的心肌酶谱，发现乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、α-羟丁酸脱氢酶（HBMB）均有不同程度的升高，其中模型组 CK 和 CKMB 较空白组明显升高（P<0.05），提示模拟失重四周后大鼠心肌组织有不同程度的损伤，ASI 不同剂量组针对升高的心肌酶有降低趋势，说明ASI 对模拟失重造成的心肌损伤具有一定程度的修复作用。

2.3 模拟失重四周对大鼠血清 Ca2+ 浓度的变化影响及刺五加注射液的干预作用

模拟失重四周，大鼠心肌受到不同程度的损伤，心肌细胞的通透性发生变化，细胞内钙超载，相应钙外流减少，不足以维持心肌正常的舒缩活动，损伤持续，检测结果见表7，发现模拟失重四周大鼠血清中钙离子浓度有下降趋势，ASI 对钙离子浓度的影响与模型组比较虽无统计学差异，但有升高趋势。

Table 7 Four weeks of simulated weightlessness on the changes of serum Ca2+ concentration in rats and the effect of acanthopanax senticosus injection表7 模拟失重四周对大鼠血清 Ca2+ 浓度变化及刺五加注射液的影响

2.4 模拟失重四周大鼠心肌组织相关 mRNA 表达变化及刺五加注射液的干预作用

相对表达分析结果或样本拷贝数见表8，模拟失重四周，分析大鼠心肌组织发现：模型组较空白组α-actin 表达量增高，ASI 高剂量组α-actin 表达具有降低趋势，可能说明模拟失重四周对大鼠心肌没有达到严重损伤的程度，同时，也说明 ASI 具有改善心功能的作用。模型组大鼠心肌组织 CaN mRNA 表达量较正常组升高，ASI 剂量组对模型组升高的CaN mRNA 有不同程度的降低作用，小剂量组降低最明显（P<0.001）。模型组大鼠心肌组织 Myh6 mRNA 表达量较正常组降低，ASI 高中剂量组 Myh6 mRNA 表达明显升高（P<0.01）。模型组大鼠心肌组织 Myh7 mRNA 表达量较正常组明显降低（P<0.05），ASI 中剂量 Myh7 mRNA 表达组明显升高（P<0.01）。模型组大鼠心肌组织 ANF mRNA 表达量较正常组升高，ASI 高中剂量组 ANF mRNA 表达升高，各剂量组间存在剂量关系。模型组大鼠心肌组织 BNP mRNA 表达量较正常组升高，ASI 中剂量组 BNP mRNA 表达明显降低（P<0.01）。

Table 8 The effects of simulated weightlessness on mRNA expression changes in myocardial tissue of rats and the intervention effect of acanthopanax senticosus injection表8 模拟失重四周对大鼠心肌组织 mRNA 表达变化的影响及刺五加注射液的干预作用

2.5 模拟失重四周大鼠心肌组织 CaN、NFAT3 和 P-NFAT3 的表达变化及刺五加注射液的干预作用

如表9 及图1 所示，模型组大鼠心肌组织 CaN 表达量较正常组升高；与模型组比较，ASI大剂量组 CaN 表达略有降低，中小剂量组明显升高；模型组 NFAT 3 表达与空白组比较，明显升高；与模型组相比，ASI 三个剂量组 NFAT 3 表达量明显降低；模型组 P-NFAT 3 表达较空白组明显降低；同时ASI 三个剂量组也存在表达降低的现象。

Fig. 1 Simulated weightlessness on the expression changes of CaN, NFAT3 and P-NFAT3 in myocardial tissue of rats and the intervention effect of acanthopanax senticosus injection图1 模拟失重对大鼠心肌组织 CaN、NFAT 3 和 P-NFAT 3 的表达变化及刺五加注射液的干预作用

Table 9 Expression changes of CaN, NFAT 3 and P-NFAT 3 in myocardial tissue of rats after simulated weightlessness and the intervention effect of acanthopanax senticosus injection表9 模拟失重四周大鼠心肌组织 CaN、NFAT 3 和 P-NFAT 3 的表达变化及刺五加注射液干预作用

3 讨论

航天员在失重环境停留返回地球表面普遍出现心血管功能失调，严重影响其立位耐力及运动能力。目前对失重状态下心血管功能失调发生机制仍不十分清楚。为保证航天员的健康与工作效率，各国都在积极研究对抗措施，对抗心脏功能失调的有效措施除了一些物理措施外，还有下体负压、体育锻炼、人工重力、套带、补充盐水等，未见有效的对抗药物出现[11]。

3.1 传统中药刺五加的心血管防护作用机理

刺五加作为一种中药在防治心血管功能失调方面发挥了一定的作用[12]。刺五加提取物能增加心肌血流量，降低冠脉阻力、减慢心率、降低血压，同时，减少心肌耗氧量及心肌耗氧指数，降低心肌氧利用率，还能减弱病灶区域超微结构的损害，加快亚细胞结构的再生，减缓心肌梗死[13]。对小鼠血栓形成有保护作用[9]，抑制血栓形成[14]，改善红细胞膜流动性，降低全血粘度，改善血液流变学状况[15]，具有明显的负性肌力作用，其作用与维拉帕米类似[16]。对于急性心肌梗塞患者，能改善左室舒张功能[17]，通过保护内源性自由基清除剂超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽（Glutathione, GSH-Px）活性，减轻心肌细胞膜脂质过氧化的损伤，增强心肌细胞的抗自由基损伤能力，保持心肌细胞膜结构的完整性，避免了心肌细胞内 Ca2+超负荷及心肌细胞不可逆性损伤，明显改善了缺血再灌注损伤心肌的预后，具有钙通道阻滞作用[18-19]。

3.2 刺五加注射液通过改善心脏长轴/短轴指标抗失重心血管功能紊乱

模拟失重四周大鼠心脏超声发现，模型组心率较空白组明显升高（P<0.05），刺五加注射液各个剂量组都不同程度能减慢心率，其中以中剂量组较明显，但无统计学意义；心脏短轴超声结果发现，左室前壁舒张末期厚度（LVAW; d）、左室前壁收缩末期厚度（LVAW; s）、左室舒张末期内径（LVID; d）、左室收缩末期内径（LVID; s）、左室后壁舒张末期厚度（LVPW; d）和左室后壁收缩末期厚度（LVPW; s）较空白组有减小趋势，其中刺五加注射液剂量组对 LVAW; d 和LVAW; s 对 LVPW; d 和 LVPW; s 有不同程度的改善作用；心脏长轴超声结果发现，模型组大鼠左室舒张末期室间隔厚度（IVS; d）、左室收缩末期室间隔厚度（IVS; s）、左室舒张末期内径（LVID; d）、左室收缩末期内径（LVID; s）、左室后壁舒张末期厚度（LVPW; d）和左室后壁收缩末期厚度（LVPW; s）较空白组均有不同程度的减小，刺五加注射液的心脏长轴参数在一定程度上有改善作用；模型组大鼠心脏超声短轴和长轴的左室射血分数（EF）和左室缩短率（FS）均有不同程度的升高，其中刺五加注射液剂量组升高较模型组更明显，说明刺五加注射液能够增加模拟失重状态下大鼠心脏的射血分数和左室缩短率，即具有提高心脏功能的作用。模型组大鼠短轴和长轴的每搏输出量（SV）较空白组减少，刺五加注射液小剂量组对大鼠心脏长轴的每搏量增加明显。模型组大鼠短轴和长轴的心排量（C0）较空白组均有降低，刺五加注射液小剂量组对大鼠心脏长轴和短轴的心排量增加明显（P<0.05）。超声结果提示，模拟失重四周心血管功能发生了改变，刺五加注射液对模拟失重心血管功能的变化具有不同程度的调整作用。

3.3 刺五加注射液通过调节血清心肌酶水平缓解失重导致的心血管损伤

心肌酶是与心肌损伤相关的一组酶，心肌损伤后，心肌细胞膜通透性增加，使得心肌细胞内的细胞酶释放入血，根据心肌损伤程度的不同，血清酶升高的幅度也不同。因此，以血清酶的变化可以反映心肌损伤的发生及程度[20]。模拟失重四周后，检测大鼠血清心肌酶谱，发现 LDH、AST、CK、CKMB、HBMB 均有不同程度的升高。其中，模型组 CK 和CKMB 较空白组明显升高（P<0.05），提示模拟失重四周后大鼠心肌组织有不同程度的损伤，刺五加剂量组对升高的心肌酶有降低趋势，说明刺五加注射液对模拟失重造成的心肌损伤具有一定程度的修复作用。

3.4 刺五加注射液通过调节信号通路 Ca2+/CaN/NFAT 3 基因和蛋白表达保护失重下心血管系统

信号通路 Ca2+/CaN/NFAT3 中 CaN 是一种分布广泛、功能多样的信号酶，其介导的信号通路在心血管的形态发生中起重要作用，并参与心肌肥大及心肌调亡、血管平滑肌细胞增值和内皮细胞功能的调节，心肌细胞在心肌肥厚因素刺激下，可通过去磷酸化NFAT3 与心肌转录因子（GATA4）相互作用，活化多种心肌肥厚相关基因，最终导致心肌重构[21-22]，进而诱导原癌基因c-fos 等表达，继之胎儿基因β-MHC、ANF、BNP 表达增加，结果使心肌收缩蛋白基因α-actin、MLC-2 等表达上调，蛋白合成增加，细胞体积增大，心肌肥大发生[23]。研究发现，模拟失重四周，模型组大鼠心肌组织 CaN mRNA 表达量较正常组升高，刺五加注射液剂量组对模型组的升高有不同程度的降低趋势。结果与前期发现的模拟失重 CaN 表达量降低不一致，分析原因可能是，前期分析的是模拟失重二周 CaN 的表达变化是降低的，本课题研究的是模拟失重四周大鼠心肌组织的 CaN 表达，由此可以推断模拟失重不同时期对 CaN 的影响是不同的，总的来说，模拟失重引起 CaN 表达量改变，有可能是模拟失重心血管失调的发生的分子基础。

信号通路 Ca2+/CaN/NFAT 3 下游表达基因包括α-MHC、β-MHC、ANF、BNP、α-actin 等，其中 ANF，即心钠素，也称心房利钠因子，是一种心脏内分泌激素，具有强大的利尿、利钠、舒张血管、降低血压、抑制肾素—血管紧张素—醛固酮系统及交感神经系统的兴奋性的作用[24-25]。BNP 即 B 型利钠肽，主要在心室合成。可扩张血管，降低外周阻力，降低心脏搏出量，减慢心率，降低心输出量；有利尿作用[26-27]；亦可抑制肾素—血管紧张素—醛固酮系统和交感神经系统，抑制内皮素和垂体加压素释放，从而调节水盐平衡，改善血容量，降低心脏前后负荷，降低血压[28-29]。α-MHC/β-MHC，即心肌肌球蛋白重链α和β，是心肌肌原纤维的主要成分和收缩蛋白，α-MHC 具有高 ATP 酶活性，产生快速收缩，β-MHC 具有低 ATP 酶活性，产生慢速收缩[30]。因此，研究α-MHC、β-MHC 基因表达，从本质上讲与研究心肌收缩力的改变一致。α-actin 属于肌动蛋白的一种，广泛表达于正常心肌细胞肌浆内[32]，α-actin 在肌动蛋白的三种类型中属于肌肉型，参与多种真核细胞的机能，如收缩、变形激化和细胞分裂，在心肌肥大、冠心病猝死、心梗、高功率微波辐照心肌、心肌炎等情况下均出现表达减弱；并且，心肌损伤越重，α-actin 的表达越少，可能与心肌损伤、缺血缺氧、炎症等因素有关[33]。分析实验结果，发现模拟失重四周，ANF mRNA 表达量较正常组升高，与空白组和模型组比较，刺五加注射液中剂量组 ANF mRNA 表达升高，给药各组间存在剂量关系；BNP mRNA 表达量较正常组升高，与空白组和模型组比较，刺五加注射液中剂量组 BNP mRNA 表达明显降低（P<0.01）。模型组心肌组织 Myh6 mRNA 表达量较正常组降低，与空白组和模型组比较，刺五加注射液中剂量组 Myh6 mRNA 表达明显升高（P<0.01）；Myh7 mRNA 表达量较正常组明显降低（P<0.05）；与模型组比较，刺五加注射液中剂量 Myh7 mRNA 表达明显升高（P<0.01）；模型组α-actin 表达量增高，刺五加注射液高剂量组α-actin 表达具有降低趋势，可能说明模拟失重四周对大鼠心肌的损伤没有达到严重的程度；同时，也说明刺五加注射液具有改善心功能的作用。这些结果表明信号通路 Ca2+/CaN/NFAT 3 下游表达基因α-MHC、β-MHC、ANF、BNP、α-actin，在模拟失重四周时，均发生了变化，直接影响了心肌收缩功能的改变，导致心血管功能失调，而刺五加注射液对模拟失重引起的心肌功能的改变具有不同程度的调整作用。

总之，通过心脏超声、心肌酶谱及 Ca2+/CaN/NFAT 3 信号通路分析发现，模拟失重四周大鼠心肌在一定程度上有损伤出现，刺五加注射液对这些损伤具有一定程度上的修复作用，即刺五加注射液可能具有提高心功能的作用。

4 结论

本项目研究中药单体刺五加注射液对模拟失重大鼠心血管功能失调的防护机制，在前期发现的模拟失重心血管功能失调相关蛋白钙调神经磷酸酶的基础上，研究该蛋白相关信号通路Ca2+/CaN/NFAT 3 的变化情况及刺五加注射液的干预作用。发现，刺五加注射液能够通过增加大鼠心脏收缩和舒张末期左室厚度，提高每搏输出量和心排量，降低心率达到调节模拟失重大鼠心血管功能失调的作用。而且，刺五加注射液能够影响钙调神经磷酸酶的表达，使 Ca2+/CaN/NFAT 3 信号通路发生变化，导致下游表达基因发生改变，最终影响与心肌收缩力直接相关的基因的表达，外在表现为心血管功能的失调，以高剂量作用最为明显。这一发现将为未来研究载人航天对抗心血管功能失调的措施提供新的防护途径，对载人航天医监医保具有重要的参考价值。因此，揭示航天特殊环境下心血管功能变化本质是寻找解决方案的关键，可能为下一步研制药物确定靶标，或为其他医监医保措施研制提供参考。