Box-Behnken 设计—效应面法优化 pH 敏感主动靶向紫杉醇脂质体处方和体外细胞毒性研究

王晓萍，李 丹，张恩南

（沈阳医学院附属中心医院，辽宁 沈阳 110000）

癌症已经严重地威胁着人类的身体健康[1-4]。化学治疗作为癌症治疗的主要方式之一，由于其特异性差而导致的全身毒性高的特点，在临床的应用是有限的[5-8]。故为了解决高毒副作用、增强靶向性以及增强药物的治疗作用，开发新型治疗型靶向药物传递系统成为了药剂学工作者研究的重点内容之一。

研究表明，肿瘤组织与正常组织具有显著性的差别，包括低 pH、高浓度还原性 GSH 和 ROS以及特定酶的高表达等一系列特征[9]。这些区别于正常组织的特点为药物传递系统的设计创造了可能。基于肿瘤微环境的特殊性质，本文设计了 cRGDyK 小肽介导的具有 pH 敏感主动靶向的紫杉醇脂质体。此脂质体具有以下性质：①当静脉注射到体内后，其能够延长血液循环时间，有效的靶向到肿瘤部位。②通过 cRGDyK 小肽的介导内吞方式增加药物的细胞摄取。③在肿瘤细胞的酸性环境下，pH 敏感脂质体快速释放 PTX，从而增加 PTX 在肿瘤细胞中的蓄积，提高 PTX的抑瘤作用。

Box-Behnken 设计—效应面法是用于考察评价指标和影响因素之间关系的一个经典的处方优化方法[10-11]。本文采用薄膜分散法制备脂质体，Box-Behnken 设计—效应面法进行处方优化并筛选出最优处方，考察由最优处方制备的脂质体的理化性质以及细胞水平研究等。

1 仪器与材料

JY9222D 超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所），RE-1002 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），C170 恒温细胞培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），GMSP-5 超净工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司），V800 倒置显微镜（上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）。

紫杉醇（paclitaxel，PTX，北京华风科技有限公司），大豆磷脂（PC＞96%，上海艾伟特医药科技有限公司），胆固醇（cholesterol，天津市博迪化工股份有限公司），葡聚糖 G50（如吉生物科技有限公司），cRGDyK-PEG2000-N=CH-Chol（cRPSC实验室自制），DMEM 培养基（美国 Gibco公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，杭州四季青生物制品公司），胰酶和噻唑蓝（美国Sigma-Aldrich 公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 cRGDyK 介导的 pH 敏感长循环紫杉醇脂质体的制备

2.2 紫杉醇体外分析方法的建立

2.2.1 色谱条件

采用高效液相色谱法（HPLC）测定紫杉醇含量。色谱条件：

色谱柱：Phenomenex C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈—水（50 : 50,v/v）；流速：1.0 mL min-1；检测波长：230 nm；柱温：30oC。

2.2.2 标准曲线的绘制

精密称取紫杉醇 5 mg，置于 50 mL 量瓶中；甲醇定容制得紫杉醇储备液（100 μg·mL-1）。量取适量储备液，甲醇定容，终浓度分别为 1～20 μg·mL-1的紫杉醇溶液；HPLC 测定其峰面积（A）。以药物浓度为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，得到标准曲线方程为：A= 125108C-1099.9（R2=0.999 9）。结果表明，紫杉醇在 1～20 μg·mL-1质量浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

2.3 脂质体包封率和载药量的测定

精密称取“2.1 cRGDyK 介导的 pH 敏感长循环紫杉醇脂质体的制备”项下制备的脂质体1.0 mL 两份，一份加入 10 mL 容量瓶中，并加 1 mL 甲醇破乳，去离子水定容；另一份加入Sephadex G50 柱顶端，去离子水洗脱后合并洗脱液，加入 1 mL 甲醇破乳后用去离子水定容。分别用 HPLC 法检测药物含量。并按照下式计算包封率（encapsulation efficiency,EE / %）。

其中：A1为过柱后样品的峰面积，A2为未过柱样品的峰面积。

2.4 Box-Behnken 设计—效应面法

预实验筛选出影响包封率较明显的三个因素，为磷脂浓度（mg·mL-1）（X1）、脂胆比（X2）和药脂比（X3），在此三个水平上利用包封率优化处方，结果见表1。

Table 1 Variables in the Box-Behnken design表1 Box-Behnken设计—效应面法中的变量

通过 Box-Behnken 软件分析，拟合方程如下：

社会文化多元化拓展了学校德育工作的空间，拓宽了学生的视野，丰富了学生的认识，给学校德育工作带来新的机遇。同时，社会文化多元化对学校德育的目标、内容提出了严峻的挑战；科学技术的迅速发展对学校德育的方法和手段提出了挑战；德育主体的变化使学校德育面临着复杂的变化。由于学生心理发展还不成熟，对价值观的判断能力、选择能力还不是很强，容易产生认识的错误，给学校德育工作提出了新的挑战和要求。

2.5 方差显著性检查

拟合方程的R2较高并接近 1，表明该方程的拟合程度较好，可以用该模型对其处方工艺进行预测和优化。该模型X2(P=0.01)、X12(P=0.0001)、X22(P=0.0032) 显著，其他均不显著，见表2、表3 和图1。

Fig. 1 Response surface for encapsulation efficiency showing interactions among representative factors图1 各因素交互作用对包封率曲面效应图

Table 2 The composition and observed responses in Box-Bchnken design for cRPSLP/PTX表2 Box-Bchnken 设计—效应面法优化 cRPSLP/PTX 处方的组合和相应值

Table 3 Significance test of coefficient in regression equation表3 回归方程中系数的显著性检验

2.5.1 设计—效应面的优化与预测

利用拟合方程，通过 Design Expert 8.0.6 绘制三个因素影响包封率的三维效应面图。根据Box-Behnken 设计—效应面确定最优处方：X1= 17.49,X2= 3.87,X3= 8.00，预测的包封率（EE / %）为 65.00%。按照最优处方制备三批脂质体，以包封率为指标并与预测值比较，测定其粒径和 zeta电位，结果见表4 所示。从表中可知，实测值与模型预测值高度一致，制备脂质体的方法重现性较好，说明该模型具有良好的预测性。

Table 4 characterization of optimal cPSLP/PTX表4 优化后 cPSLP/PTX 的表征

2.6 体外释放实验

采用透析法考察紫杉醇在脂质体中的体外释放实验。为了考察其 pH 敏感特性，选用不同 pH的 PBS 缓冲液（pH 5.0和 pH 7.4）作为释放介质。由于紫杉醇为水难溶性药物[12]，因此在溶出介质中加入 0.5% 的吐温 80 用于增溶紫杉醇，从而符合漏槽条件。简言之，量取紫杉醇脂质体5.0 mL，置于透析袋（Mw: 2000 Da）。将捆扎好的透析袋置于含有 200 mL 的不同 pH 的 PBS缓冲液中，37oC 水浴震荡。在设计的时间点吸取 1 mL 释放介质并同时添加 1 mL 新鲜介质，采用 HPLC 法测定药物含量并计算药物累计释放百分率。由图2 可知，普通紫杉醇脂质体在 pH 5.0 和 7.4 两种条件下的释放实验无明显的不同，并且在 72 h 释放量达到 76.86%。而 pH 敏感脂质体（cRPSLP/PTX）在中性 pH 值释放量仅有 42.53%，这是由于 PEG 修饰的脂质体会显著降低药物的释放速率的缘故。而当 pH 值降低至 5.0 时，cRPSLP/PTX 组的释放量显著增多，72 h 的累计释放量达到 65.35%。上述结果表明，cRPSLP/PTX 脂质体具有明显的 pH 敏感性。这是由于 cRPSC 中的腙建在酸性条件下断裂，PEG 层脱去从而加速药物释放[13]。

Fig. 2 In vitro release of different formulations in different pH图2 不同 pH 条件下不同制剂的体外释放实验

2.7 体外细胞毒性研究

通过 MTT 法考察脂质体的细胞毒性。简要之，将 MCF-7 或 HepG2 细胞接种到 96 孔板（103/孔）后培养过夜，不同浓度的空白脂质体（100 μL）共孵育。每个浓度设置 4 个平行孔，同时，设空白对照组。另外，考察载药脂质体在 HepG2 细胞的细胞毒性研究，实验操作方法同上。置培养箱中孵育 72 h，弃去培养液体，加入 10 μL 的 MTT 溶液（5 mg·mL-1），继续孵育 6 h 后，加入 100 μL 的 DMSO，酶标仪测定吸光度值（OD）（490 nm），并计算细胞存活率（cell viability）。从图3A 可知，在 MCF-7 和 HepG2 细胞中，空白脂质体在较高浓度时均没有明显的细胞毒性。对载药脂质体的 MTT 实验中发现，不同组别对 HepG2 肿瘤细胞的细胞毒性大小是：cRPSLP/PTX>LP/PTX>PTX，见图3。

Fig. 3 MTT assay of different formulations: (A) blank liposomes; (B) PTX loaded liposomes图3 不同制剂的细胞毒性实验：(A) 空白脂质体；(B) 载PTX的不同脂质体

3 讨论

（1）紫杉醇为水难溶性药物，其和磷脂膜的相互作用造成紫杉醇包载于脂质体中的包封率较高。本文考察制备脂质体过程中的三个因素：磷脂浓度、脂胆比、脂药比，以包封率为评价指标进行处方优化。通过 Box-Behnken 设计—效应面实验设计并确定最优处方。

（2）从效应面图可知，磷脂的浓度（X1）、脂胆比（X2）、脂药比（X3）对包封率有不同程度的影响。升高磷脂浓度，包封率在一定范围内先增大后减小，磷脂浓度过高会导致包封率下降。这主要是由于膜稳定性下降，药物的包裹紧密程度降低。改变脂胆比会导致包封率在一定范围内先增大后减小。胆固醇是脂质体成膜材料中重要的组成部分，其主要作用是可以稳定脂质体膜。但是，如果胆固醇含量过高则会导致其无法有效的嵌入磷脂双分子层，制得的脂质体膜会不稳定，从而降低包封率。脂药比对于包封率的影响较小，这可能跟药物的强疏水性有关。

（3）研究表明，肿瘤微环境 pH 低于正常组织的 pH 值。因此，利用肿瘤部位和正常部位pH 值不同这一特点，进行体外释放研究。结果表明，cRPSLP/PTX 脂质体具有明显的 pH 敏感性，这主要是由于其在酸性环境下的腙建的断裂导致 PEG 外层的脱去，从而增加药物的释放[13]。

（4）采用 MTT 实验对空白脂质体和载药脂质体进行细胞毒性研究。实验结果表明，空白脂质体无明显的细胞毒性。载药脂质体的 MTT 实验表明，cRPSLP/PTX 组和 LP/PTX组的 IC50值均小于 PTX 组。说明脂质体能增加细胞摄取，从而增强细胞毒性。而 cRPSLP/PTX 组的细胞毒性显著高于 LP/PTX 组，这种现象主要是由于 cRPSLP 介导的肿瘤细胞特异性内吞提高细胞摄取后，pH 敏感材料在肿瘤细胞内可显著地增加药物释放速率，从而增加细胞毒性[14]。

4 结论

本文通过 Box-Behnken 设计—效应面法优化紫杉醇脂质体（cRPSLP/PTX）的制备工艺，制备高包封率的 cRPSLP/PTX 脂质体，最优处方的实际值的结果和预测值高度一致，说明该模型能够准确地优化脂质体的处方工艺。优化后制备的脂质体的包封率较高，粒径较小。体外释放实验表明该脂质体具有明显的 pH 敏感特性，并具有很好的缓释行为。MTT 实验中可知，该脂质体可以通过受体介导的特异性细胞内吞和 pH 触发的药物释放，增加细胞摄取和增强细胞毒性。