他达拉非粒径分布对其片剂溶出行为和生物等效性的影响

黄小宏，程 刚，王 征

（1. 沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110015；2. 珠海联邦制药股份有限公司 中山分公司，广东 中山528400）

他达拉非是一种有效的磷酸二酯酶 5（PDE 5）抑制剂，通过选择性抑制 PDE 5，提高环磷酸鸟苷（cGMP）浓度，松弛动脉血管平滑肌，增强阴茎勃起功能，达到治疗勃起功能障碍（ED）的目的[1-2]。该药物具有活性高，作用持久，不良反应少等优点[3]。他达拉非片由美国礼来公司研发，商品名为 Cialis。根据欧盟 EMEA 关于他达拉非片的科学性论述可知，他达拉非的生物药剂学分类（BCS）为 Ⅱ 类，即低溶解性—高渗透性，且他达拉非片在制备过程中需要对原料进行微粉化[4]。他达拉非属于难溶性药物，目前，有研究通过制备固体分散体[5-6]、纳米混悬液[7]等方式减小原料粒径，提高药物的溶解度和生物利用度。然而，上述技术存在工艺复杂、成本较高等不足。因此，我们从商业化生产可行性角度考虑，通过直接粉碎原料的方式降低原料粒径，并研究不同粒径分布的他达拉非对其片剂的溶出曲线和生物等效性的影响，以制备出与Cialis 生物等效的产品。

1 仪器与材料

1.1 仪器

GF-300AX 型高速粉碎机（上海天祥健台）；J-50 型气流粉碎机（意大利马西姆）；SHK-220B型湿法混合制粒机（北京航天工艺研究所）；YK-160 型摇摆式颗粒机（江苏瑰宝集团）；TG-ZA-Ⅱ型热风循环烘箱（常州震华干燥设备厂）；HSD-100 型混合机（浙江迦南）；S250PLUS 型压片机（淄博伊马新华）；GBS-150A 型高效包衣机（温州制药机械厂）；UPS-4 型铝塑铝包装机（德国乌尔曼）；Mastersizer 3000 型马尔文粒度仪（英国马尔文）；RC12A 型溶出度测定仪（天津天大天发）；LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津）。

1.2 材料

他达拉非片（美国礼来，商品名 Cialis，批号 C922336，规格 10 mg）；他达拉非（珠海联邦制药股份有限公司，批号 1609048、1906020）；Pharmatose 200M 乳糖（荷兰 DMV）；微晶纤维素（山东聊城阿华）；交联羧甲纤维素钠（德国 JRS）；十二烷基硫酸钠（湖南尔康）；HPCL 羟丙纤维素（日本曹达）；硬脂酸镁（山东聊城阿华）；295K620011 薄膜包衣预混剂（上海卡乐康）；他达拉非工作对照品（珠海联邦制药股份有限公司，批号：120216）；乙腈、异丙醇、正己烷为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 不同粒径分布原料的制备

取他达拉非原料适量，分别采用高速粉碎机（100 目筛）和气流粉碎机（进气压力 0.6 MPa）进行粉碎，即得高速 100 目原料和气流粉碎原料。

2.2 原料粒径分布的检测

按照《中国药典》2020 年版规定的粒度和粒度分布测定法[8]，采用激光衍射法（干法）测定，设定仪器参数（振动进样速度 50%，分散气压 3.5 MPa，扫描时间 10 s，折射率 1.52，遮光度0.5%～5%）。分别取上述粉碎后原料适量，测试粒径分布，结果见表1。

Table 1 Results of particle size distribution表1 粒度分布检测结果

由表1 检测结果可知，与高速 100 目原料相比，气流粉碎原料的粒径分布D10、D50和D90均显著下降。

2.3 他达拉非片的制备

参考美国 FDA 网站公布的 Cialis 说明书中的处方描述部分[9]，片芯辅料选择乳糖、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、羟丙纤维素、硬脂酸镁。制备工艺参考欧盟EMEA 关于他达拉非片科学性论述中药品的描述[4]，采用湿法制粒工艺分别针对高速粉碎原料和气流粉碎原料进行他达拉非片制备。制备方法为称取羟丙纤维素 0.575 kg，加入 6.612 kg 纯化水搅拌至澄清透明，备用。称取粉碎后原料 1.0 kg，再分别加入乳糖 17.88 kg、交联羧甲纤维素钠0.9 kg、十二烷基硫酸钠 0.07 kg，混匀，加入羟丙纤维素溶液湿法制粒，干燥整粒，加入微晶纤维素 3.75 kg、交联羧甲纤维素钠 0.7 kg、硬脂酸镁0.125 kg，混匀，压片，包衣，即得他达拉非片（规格 10 mg，批号为 71218301、Y55011191211，对应原料粒度分布D90分别为 34.4、16.0 μm）。

2.4 溶出度测定方法的建立

2.4.1 色谱条件

色谱柱为辛烷基硅烷键合硅胶（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）；流动相为 0.1% 三氟乙酸溶液—乙腈（55∶45）；检测波长285 nm；流速1.2 mL·min-1；柱温40 ℃；进样体积50 μL。

2.4.2 对照品溶液

取他达拉非对照品约 20 mg，精密称定，置于 100 mL 量瓶中，加乙腈 20 mL 使溶解，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置于100 mL 量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀即得。

2.4.3 供试品溶液

取他达拉非片 6 片，按照溶出度与释放度测定法（桨法）[10]，参考他达拉非片进口药品注册标准[11]，以 0.5% SDS 溶液为溶出介质，介质体积 1 000 mL，转速为 50 rpm，温度 37.0 ℃，分别在 10、30 min 时取溶出液 10 mL（及时补液），滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4.4 方法学验证

（1）专属性试验

滤膜干扰试验：取他达拉非片，依法测定，在 10、30 min 分别取溶出液两份，一份用孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤，作为供试品溶液；另一份3 000 rpm 离心 10 min，取上清液作为供试品溶液，按照“2.4.1 色谱条件”测定峰面积。滤膜过滤供试品溶液峰面积分别是离心所得上清液供试品溶液峰面积的 99.12% 和 99.92%，表明滤膜不干扰本品溶出度测定，见图1（A、B、C、D）。

Fig. 1 HPLC chromatograms of the test of specificity图1 专属性试验 HPLC 色谱图

辅料干扰试验：取空白辅料溶液，按照“2.4.1 色谱条件”进样分析。结果表明，空白辅料不干扰本品溶出度测定，见图1（E）。

综上可知，该方法专属性良好。

（2）回收率试验

称取空白辅料 12 份，置于 200 mL 量瓶中，另精密称取他达拉非原料约 8.0、16.0、32.0、40.0 mg，各3 份，置上述 200 mL 量瓶中，加乙腈 40 mL 超声使溶解，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 5 mL，分别置于 12 个 100 mL 量瓶中，再加溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

另精密称取他达拉非工作对照品约 20 mg，置于 100 mL 量瓶中，加乙腈 20 mL 超声使溶解，用溶出介质稀释至刻度；精密量取上述溶液5 mL 置于 50 mL 量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表2。

Table 2 Results of the test of recovery rate表2 回收率试验结果

由表2 可知，该法回收率为 99.14%～100.73%，RSD 为 0.49%，可知本法回收率良好。

（3）线性试验

取他达拉非工作对照品约 20 mg，精密称定，置于 100 mL 量瓶中，加入 20 mL 乙腈，超声使溶解，再加溶出介质稀释至刻度，作为贮备液。精密量取贮备液适量，用溶出介质稀释，制成不同浓度溶液，按照不同进样体积进行测定，以进样量对峰面积进行线性回归，结果见表3。

Table 3 Results of the test of linearity表3 线性试验结果

结果表明，他达拉非进样量在 0.105～2.090 μg 范围内，与峰面积线性关系良好，线性方程Y= 1688985X+ 798；相关系数r= 1.000 0。

（4）溶液稳定性试验

取他达拉非片，依法测定，在 10、30 min 分别取溶出液，滤过，取续滤液作为供试品溶液，室温放置 12 h，分别于 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h 测定峰面积，RSD 值分别为 0.20%、0.20%，说明供试品溶液室温放置 12 小时内稳定性良好。

2.5 溶出曲线的测定

2.5.1 标准介质（0.5% SDS 溶液）溶出曲线

分别取自制品和 Cialis，按照“2.4 溶出度测定法”测定，溶出介质选用 0.5% SDS 溶液，分别于 5、10、15、30、45、60 min 取样测定，结果见表4，相应溶出曲线见图2（A）。

Fig. 2 Dissolution curves of self-made products and Cialis in 0.5% SDS (A), 0.3% SDS (B) solutions and water (C)图2 自制品和 Cialis 在 0.5% SDS (A)、0.3% SDS (B) 溶液和水 (C) 中的溶出曲线图

Table 4 Dissolution curves of self-made products and Cialis in 0.5% SDS solution表4 自制品和 Cialis 在 0.5% SDS 溶液中的溶出曲线

由表4 可知，在 0.5% SDS 溶液中，自制品和 Cialis 在15 min 累积溶出度超过 85%。文献[12]指出，参比制剂与仿制制剂在 15 min 以内平均溶出率均达 85% 以上，可以判定二者溶出曲线相似。因此，可知自制品和 Cialis 在 0.5% SDS 溶液中相似。

2.5.2 其他介质（0.3% SDS 溶液、水）溶出曲线

由于溶出介质中添加了助溶剂 SDS，为了提高溶出曲线的区分效果，将溶出介质中 SDS 浓度由 0.5% 降低至 0.3% 和 0%（水），分别取自制品和 Cialis，按照“2.4 溶出度测定法”测定，分别于 5、10、15、30、45、60 min 取样测定，结果见表5、表6，相应溶出曲线见图2（B、C）。

Table 5 Dissolution curves of self-made products and Cialis in 0.3% SDS solution表5 自制品和 Cialis 在 0.3% SDS 溶液中的溶出曲线

由表5 可知，在 0.3 % SDS 溶液中，原料D90= 34.4 μm 的自制品溶出速度明显减缓，15 min累积溶出度已小于 85%，不符合与 Cialis 相似的要求。而原料D90= 16.0 μm 的自制品和 Cialis溶出速度减缓不明显，15 min 累积溶出度仍超过 85%，仍符合相似的要求。由表6 可知，由于他达拉非在水中为低溶解性[4]，各样品在水介质中溶出终点（60 min）的累积溶出度均小于 40%，通过表6 数据和图2（C）可知，原料D90= 16.0 μm 的自制品和 Cialis 的溶出曲线仍具有更好的拟合效果。

2.6 生物等效性研究

2.6.1 给药方案

根据溶出曲线测定结果，选择采用原料D90= 16.0 μm 制备的自制品（批号 Y55011191211）作为受试制剂、Cialis（批号 C922336）作为参比制剂，进行空腹条件下单中心、随机、开放、两周期、双交叉的人体平均生物等效性研究。受试者禁食过夜至少 10 小时后，次日空腹服用他达拉非片受试制剂或参比制剂，给药后 4 小时内禁食。

2.6.2 生物样品采集和处理

分别在给药 0 时（给药前 1 小时内）和给药后 0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、5.00、6.00、9.00、12.00、24.00、48.00、72.00、96.00 h（共 17 个采血点）分别由前臂静脉采血 4 mL 至已标记好含有抗凝剂（EDTA-K2）的真空采血管中，轻柔颠倒混匀 6 次，离心10 min，取上层血浆置于冻存管中，转移至 -80 ℃ 冰箱中冷藏储存，供药代动力学分析。

2.6.3 药动学结果和等效性分析

健康志愿者空腹单次口服受试制剂或参比制剂后，平均血药浓度—时间曲线见图3。根据血药浓度数据，采用非房室模型（NCA）对药动学参数（Tmax、Cmax、AUC0-t和AUC0-∞）进行估算，结果见表7。

Fig. 3 Mean blood drug concentration-time curves of test preparation and reference preparation图3 受试制剂和参比制剂的平均血药浓度—时间曲线

Table 7 Descriptive statistical results of average pharmacokinetic parameters of test preparation and reference preparation（± s, n=10）表7 受试制剂和参比制剂的平均药代动力学参数描述性统计结果（± s, n=10）

Table 7 Descriptive statistical results of average pharmacokinetic parameters of test preparation and reference preparation（± s, n=10）表7 受试制剂和参比制剂的平均药代动力学参数描述性统计结果（± s, n=10）

算术均数药动学参数 单位受试制剂（批号：Y55011191211）参比制剂（批号：C922336）Tmax h 2.90 ± 1.71 2.30 ± 1.42 Cmax ng·mL-1 185.99 ± 40.53 199.19 ± 47.54 AUC0-t h·ng·mL-1 4 550.26 ± 1 116.49 4 712.12 ± 1 213.68 AUC0-∞ h·ng·mL-1 4 778.83 ± 1 222.15 4 960.27 ± 1 377.39

由表7 可知，受试制剂与参比制剂的达峰时间Tmax、达峰浓度Cmax、AUC0-t和AUC0-∞均相近。采用平均生物等效性评价方法对Cmax、AUC0-t和AUC0-∞进行评价，经对数转换后，受试制剂与参比制剂的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞几何均值比分别为 93.63%、97.01% 和96.97%，90%置信区间分别为 88.13%～99.43%、91.03%～103.39% 和 90.58%～103.81%。可知，空腹单次口服自制品（原料D90= 16.0 μm）后，与 Cialis 比较，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的 90% 置信区间均落在 80%～125% 范围内，受试制剂与参比制剂具有生物等效性。

3 讨论

采用高速粉碎方式对他达拉非原料进行前处理，可使原料粒径降低至D90= 34.4 μm，而气流粉碎方式能使原料粒径进一步降低至D90= 16.0 μm，且随着原料粒径降低，制备所得片剂的溶出速度变快。

选择标准介质 0.5% SDS 溶液对自制品与参比制剂进行溶出行为相似性评价时，不同粒径分布原料所制产品与参比制剂均相似，无法准确区分原料粒径对溶出行为的影响。因此，为提高溶出曲线的区分力，将溶出介质中助溶剂 SDS 浓度降低至 0.3%，原料D90= 34.4 μm 的自制品溶出速度明显减缓，与参比制剂的溶出行为已不相似；而原料D90= 16.0 μm 的自制品与参比制剂的溶出速度减缓不明显，溶出行为保持相似；将 SDS 浓度继续降低至0% 时，原料D90= 16.0 μm的自制品与参比制剂的溶出曲线仍具有更好的拟合效果。最终，通过生物等效性研究证明，降低原料粒径至D90= 16.0 μm，可制备得与参比制剂生物等效的产品，可知他达拉非原料粒径分布对其片剂溶出行为和生物等效性具有至关重要的影响。