经典名方五味消毒饮的物质基准量值传递分析*

李小让,叶世芸▲,韩惠超,李向东

(1贵州中医药大学,贵州 贵阳 550002;2贵州得轩堂护康药业股份有限公司,贵州 贵阳 550008)

五味消毒饮记载于清代《医宗金鉴》,具有清热解毒,消肿散结的功效,现收录为《古代经典名方目录(第一批)》第96号方剂[1],由金银花、蒲公英、野菊花、紫花地丁、天葵子5味中药组成,均具有抗菌消炎的功效[2-6]。在配方上,金银花性寒味甘,气味芳香,能清热解表,又可解血分热毒,是治疗疮疡的要药,为君药。野菊花味辛、苦,性微寒,能清热泻火,有较强的消肿止痛作用,是臣药。蒲公英不仅能清火热,还能泄降滞气,是清热解毒、消痈散结的佳品;紫花地丁苦辛,寒能清热,故清热解毒、消痈散结用于红肿热痛;天葵子苦辛,具有清解热毒、消痈散结、利尿通淋的功效,后三者为辅药。这五味药组合在一起,可以净化气血,三焦同治,疏通中下焦,打通三焦热结,缓解湿气和肿胀。临床上常应用于五官、内科、外科、妇科等火毒湿热所致的多种全身感染性疾病的治疗[7-9]。五味消毒饮作为经典名方开发的对象之一,目前关于其文献报道多见临床研究,其化学成分的分析[10]及成分含量测定[11],尚无该物质基准量值传递的研究,制约了其开发。

物质基准的质量研究是经典名方开发过程中的关键环节[12],因此本研究在前期研究优化的煎提工艺基础上,制备15批五味消毒饮物质基准冻干粉,对其特征图谱、出膏率、水分、指标性成分含量进行测定,进行饮片-物质基准量值传递的研究,为经典名方五味消毒饮复方制剂的开发和质量控制提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

多功能煎药机(型号:JYH-B30M3;小熊电器股份有限公司);高效液相色谱仪(e2695,美国沃特世公司);超声波清洗仪(型号:ModeL9960D;天津科贝尔公司);电子分析天平(型号:AUW120D;日本岛津);冷冻干燥机(FD-1A-5O;北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 试药

绿原酸对照品(批号20051641),异绿原酸-A对照品(批号21032702),蒙花苷对照品(批号20041501),异绿原酸-C对照品(批号20112402),木犀草苷对照品(批号20060803),秦皮乙素对照品(批号10103001),均购于成都普瑞法科技开发有限公司;异绿原酸-B对照品(批号DST210823-037),隐绿原酸对照品(批号DST210427-035),新绿原酸对照品(批号DSTDX001503),均购于成都德思特科技开发有限公司。娃哈哈纯净水。甲醇、冰醋酸均为色谱纯。

五味消毒饮中五味药材均采购于道地产区及主产区,见表1,经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定,均与2020版《中国药典》记录品种一致,五味药材炮制方法与现代2020版《中国药典》炮制方法基本一致[13],均符合药典的相关规定。

表1 五味消毒饮饮片信息

2 方法与结果

2.1 五味消毒饮15批物质基准的制备及出膏率的测定

15批五味消毒饮物质基准及对应饮片批次片进行Rand函数随机排列,如表2所示。称取金银花11.19 g,蒲公英4.48 g,野菊花4.48 g,紫花地丁4.48 g,天葵子4.48 g,置于电煎药壶中,加水400 mL,浸泡30 min,文火煎煮约20 min,加入黄酒100 mL,武火煎煮5 min,趁热过300目筛,药渣同上述方法再次进行煎煮,合并两次滤液,定容至720 mL。将其置于-80 ℃预冻12 h,冷冻干燥72 h,即得五味消毒饮物质基准冻干粉。

表2 五味消毒饮15批物质基准对应饮片批次

称重计算出膏率,根据公式计算煎液的出膏率[出膏率(%)=总粉量/总饮片量×100%],照2020年版《中国药典》四部水分测定法(通则0832第二法)测定15批五味消毒饮物质基准对应实物的水分[水分(%)=冻干粉中含水量/冻干粉总重×100%],见表3。

表3 15批物质基准的出膏率及水分

结果显示,15批次五味消毒饮物质基准冻干粉的出膏率在58.74%～63.75%之间,其均值为50.94%,均未出现离散数据(平均值的70%～130%外),15批次出膏率均在此范围内,没有出现较大偏差,暂定五味消毒饮出膏率范围应在35.66%～66.22%。15批五味消毒饮物质基准冻干粉的水分范围13.11%～16.96%之间,水分的均值为14.70%,均未出现离散数据(平均值的70%～130%外),暂定五味消毒饮水分范围10.29%～19.11%。

2.2 五味消毒饮物质基准特征图谱方法的建立

2.2.1 色谱条件

Waters2695色谱柱(砖石-C18),流动相甲醇(A)-0.5%醋酸水(B),梯度洗脱(0～10 min,10%～32%A,90%～68%B;10～21 min,32%A,68%B;21～25 min,32%～46%A,68%～54%B;25～31 min,46%～48%A,54%～52%B;31～43 min,48%～80%A,52%～20%B;43～45 min,80%～10%A;20%～90%B;45～55 min,10%A;90%B),流速1 mL·min-1,检测波长为320 nm,柱温25 ℃,进样体积10 μL。

2.2.2 供试品溶液的制备

五味消毒饮基准样品供试溶液:取五味消毒饮物质基准冻干粉0.25 g,加10 mL 50%甲醇,超声30 min,冷却,定容,离心(10000 r·min-1)15 min,取上清液过0.45 μm微孔滤膜,即得。

阴性供试品溶液:分别取未加入金银花、蒲公英、野菊花、紫花地丁、天葵子的五种物质基准,按上述供试品溶液制备方法,即得。

2.2.3 对照品溶液的制备

取对照品适量,加甲醇分别配制成绿原酸1.90 mg·mL-1、木犀草苷0.09 mg·mL-1、异绿原酸-A 0.43 mg·mL-1、异绿原酸-B 0.29 mg·mL-1、异绿原酸-C 0.40 mg·mL-1、秦皮乙素0.30 mg·mL-1、蒙花苷0.10 mg·mL-1、新绿原酸0.07 mg·mL-1、隐绿原酸0.10 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.4 经典名方温经汤指纹图谱方法学考察

2.2.4.1 精密度考察

取五味消毒饮物质基准供试品溶液1份,按2.2.1项下色谱条件,连续进样6次,隐绿原酸(4号峰)面积最大且分离度好,为参照峰,得出各共有峰相对保留时间和相对峰面积。特征峰相对保留时间RSD值在0.00%～0.60%之间,相对峰面积RSD值在0.00%～2.75%之间,表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 重现性考察

取五味消毒饮物质基准供试品溶液1份,平行进样6次,特征峰相对保留时间RSD值在0.00%～0.43%之间,相对峰面积RSD值在0.00%～2.43%之间,表明方法的重复性良好。

2.2.4.3 稳定性考察

取五味消毒饮物质基准供试品溶液1份,分别在0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h进行测定,特征峰相对保留时间RSD值在0.00%～1.07%之间,相对峰面积RSD值在0.00%～2.89%之间,说明待测样品在24 h内稳定性良好。

2.2.5 15批五味消毒饮物质基准的指纹图谱考察

2.2.5.1 指纹图谱研究

将15批五味消毒饮物质基准指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版),以S1色谱图为参照图谱,采用中位数法,Mark峰匹配后生成对照图谱。15批五味消毒饮物质基准特征图谱叠加图见图1,相似度见表4,从结果可知,15批五味消毒饮物质基准的特征图谱相似度分别为0.998、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、0.999、0.999、1.000、1.000、0.993、1.000、1.000、0.999、0.999,均大于0.9,表明相似度良好,表明五味消毒饮物质基准的制备工艺稳定,不同批次间的差异较小,见表4。

表4 15批五味消毒饮物质基准指纹图谱相似度

2.2.5.2 指纹图谱的峰归属

在320 nm波长下,确定10个共有峰,根据对照品指认出9个色谱峰,分别是1号峰(新绿原酸)来自金银花、野菊花;2号峰(秦皮乙素)来自紫花地丁;3号峰(绿原酸)来自金银花、蒲公英、野菊花;4号峰(隐绿原酸)、5号峰(木犀草苷)、6号峰(异绿原酸-A)、7号峰(异绿原酸-B)、8号峰(异绿原酸-C),均来自金银花、野菊花;9号峰(蒙花苷)来自野菊花,见图2和图3。

图2 混合对照品图谱与五味消毒饮物质基准HPLC图谱

注:1.金银花阴性;2.紫花地丁阴性;3.野菊花阴性;4.蒲公英阴性;5.金银花单煎;6.蒲公英单煎;7.野菊花单煎;8.紫花地丁单煎;9.天葵子单煎;10.五味消毒饮物质基准;11.天葵子阴性。

2.2.6 五味消毒饮物质基准指标性成分的含量测定

2.2.6.1 色谱条件

同“2.2.1”项。

2.2.6.2 供试品溶液的制备

同“2.2.2”项。

2.2.6.3 线性关系考察

取混合对照品储备液适量,加甲醇配制成不同质量浓度的对照品溶液。绿原酸质量浓度为1.90 mg·mL-1、0.95 mg·mL-1、0.475 mg·mL-1、0.2375 mg·mL-1、0.11875 mg·mL-1、0.059375 mg·mL-1,隐绿原酸质量浓度为0.1 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.0125 mg·mL-1、0.00625 mg·mL-1、0.003125 mg·mL-1,木犀草苷质量浓度为0.09 mg·mL-1、0.045 mg·mL-1、0.0225 mg·mL-1、0.01125 mg·mL-1、0.005625 mg·mL-1、0.0028125 mg·mL-1,异绿原酸-A质量浓度为0.43 mg·mL-1、0.215 mg·mL-1、0.1075 mg·mL-1、0.05375 mg·mL-1、0.026875 mg·mL-1、0.0134375 mg·mL-1,异绿原酸-B质量浓度为0.29 mg·mL-1、0.145 mg·mL-1、0.0725 mg·mL-1、0.03125 mg·mL-1、0.015625 mg·mL-1、0.0078125 mg·mL-1,异绿原酸-C质量浓度为0.4 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.0125 mg·mL-1,蒙花苷质量浓度为0.1 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.0125 mg·mL-1、0.00625 mg·mL-1、0.003125 mg·mL-1,新绿原酸质量浓度为0.32 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.01 mg·mL-1,秦皮乙素质量浓度为0.3 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.075 mg·mL-1、0.0375 mg·mL-1、0.01875 mg·mL-1、0.009375 mg·mL-1的一系列线性对照品溶液。以对照品质量浓度为横坐标,9种指标性成分峰面积为纵坐标,得到9种待测成分的回归方程以及相关系数值,见表5。

表5 含量测定方法学考察结果

2.2.6.4 精密度考察

取五味消毒饮冻干粉样品,按“2.2.2”项制备供试品溶液,同“2.2.1”项下色谱条件,分别连续进样测定6次,结果显示9种待测成分峰面积RSD值在0.33%～2.73%之间(表5),表明仪器精密度良好。

2.2.6.5 重复性试验

取五味消毒饮冻干粉样品,制备6份供试品溶液,按“2.2.2”项制备供试品溶液,同“2.2.1”项下色谱条件下测定,结果显示9种待测成分的平均质量分数的RSD值在0.52%～1.67%(表5),表明方法重复性良好。

2.2.6.6 稳定性试验

取五味消毒饮冻干粉样品,按“2.2.2”制备供试品溶液,同“2.2.1”项下色谱条件,分别于室温条件下放置0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h后分别测定,结果显示9种待测成分的平均质量分数的RSD值在0.8%～2.89%之间(表5),溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.6.7 加样回收率考察

取五味消毒饮冻干粉样品6份,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按比例加入对照品适量,进样测定,计算9种待测成分的加样回收率,回收率结果均符合2020版《中国药典》标准,结果显示9种待测成分的平均质量分数的RSD值在0.35%～2.87%之间(表5),表明方法重复性良好。

2.2.7 15批物质基准指标成分含量的测定及量值传递关系研究

2.2.7.1 指标成分含量的测定

按照2.2.1项下色谱条件将基准样品进样,计算样品中绿原酸、木犀草苷、异绿原酸-A、异绿原酸-B、异绿原酸-C、秦皮乙素、蒙花苷、新绿原酸、隐绿原酸的质量分数,各批次指标性成分含量测定结果见表6。

表6 15批五味消毒饮物质基准中指标成分含量(mg/g)

2.2.7.2 指标成分含量的量值传递关系研究

紫花地丁、野菊花饮片中秦皮乙素、蒙花苷含量的测定按照《中华共和国人民药典》记载的方法。根据指标性成分秦皮乙素、蒙花苷及对应批次饮片的含量测定结果,进行转移率计算,按照以下公式计算,饮片到物质基准的转移率=物质基准中指标成分总量/饮片中指标成分总量。

结果见表7,经计算2个测定指标的转移率均值依次为55.23%、11.79%。各个转移率数值均未出现离散数据,在均值70%～130%范围内。说明秦皮乙素、蒙花苷2种成分在物质基准制备过程中转移率稳定可控。

表7 15批五味消毒饮饮片指标成分的含量及转移率

3 讨论

五味消毒饮原方记载为[14]:“金银花三钱,野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子各一钱二分。水二盅,煎八分,加无灰酒半钟,再滚二、三沸时热服。渣,如法再煎服,被盖出汗为度”。对其处方剂量进行考证,明清时期,1两约为37.3克的折算方法,1钱为3.73克[15]。参考国家中医药管理局发布古代经典名方关键信息表,清代的一盅为100 mL。故拟定处方为:金银花11.19 g,蒲公英4.48 g,野菊花4.48 g,紫花地丁4.48 g,天葵子4.48 g。其中无灰酒,其色黄,甘而温,和血良,为黄酒[16]。加入水和酒的量为200 mL、100 mL。

本研究在五味消毒饮药材选择方面均采购于道地产区及主产区,并对15批次饮片按照2020版《中国药典》进行质量检查,均符合要求。前期实验以出膏率和有效成分的含量为指标,对浸泡时间、煎煮方式、煎煮时间、不同目数过滤方式进行了考察,确定药材浸泡时间为30 min;煎煮方式为电火;煎煮时间:五味消毒饮单方剂加水400 mL,煎至320 mL,加100 mL黄酒煎煮,电煎药壶从400 mL煎煮至320 mL需文火20 min,对于“滚二三沸”暂定武火5 min;300目数的滤布过滤。考虑到五味消毒饮的稳定性,故五味消毒饮选择冷冻干燥[17]。对供试品制备的超声提取法的不同溶剂100%水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇进行考察,得出50%甲醇作为提取溶剂时最佳。

本研究通过特征图谱结合出膏率及指标性成分含量进行测定五味消毒饮的饮片-物质基准的相关性及关键质量属性的传递性研究。结果表明:(1)特征图谱显示15批五味消毒饮物质基准的相似度均大于0.9,相似度良好,表明五味消毒饮物质基准的制备工艺稳定,不同批次间的差异较小,可检出10个色谱峰,并指认出9个峰,其中7个特征峰来源于金银花,8个特征峰来源于野菊花,1个特征峰来源于紫花地丁,1个特征峰来源于蒲公英。(2)出膏率显示15批次五味消毒饮物质基准冻干粉在58.73%～63.75%之间,其均值为50.94%,均未出现离散数据(平均值的70%～130%外),出膏率高可能与其提取溶剂黄酒有关,黄酒作为中药材的炮制加工品,是良好的有机溶媒,药物的有效成分如脂类、挥发油、苷类及部分生物碱等易溶于其中,因此加黄酒提取所得的出膏率较高,同时可能与其本身的粘稠相关[18]。(3)秦皮乙素来自紫花地丁,蒙花苷来自野菊花,是2020版中国药典规定的野菊花含量测定的指标成分[19],因此将这两个成分作为含量测定指标成分探索五味消毒饮的量值转移规律,饮片-物质基准的指标性成分含量及转移率结果显示秦皮乙素、蒙花苷的转移率分别为40.39%～76.45%,8.41%～16.44%,均值分别为55.23%,11.79%,在均值70%～130%范围内,均未出现离散数据。但蒙花苷的转移率较低,有研究报道[20-21],蒙花苷为热不稳定性成分,在制备五味消毒饮物质基准的过程中采用电火加热煎煮的方式制备,且煎煮时间较长,可能造成蒙花苷由饮片到物质基准的转移率较低。

因此,15批五味消毒饮物质基准对应实物(冻干粉)与标准煎液(按古籍记载制备)具有质量一致性,具备可信度和科学性,可作为五味消毒饮复方制剂研发的质量基准物质。提示在后续制剂开发的过程中需注意温度和加热时间对热不稳定成分的影响。