百合枯萎病拮抗细菌的筛选

李润根，李嘉妮，李 楠，黄 琪，艾芬婷，赵雅芳

(宜春学院 江西省作物生长发育调控重点实验室，江西 宜春 336000)

百合(Liliumspp.)属单子叶植物亚纲百合科百合属多年生草本植物[1]，具有食用价值和药用价值.食用方面，百合含有丰富的皂苷、生物碱类、酚酸甘油酯、磷脂类、微量元素以及糖类等化学成分；药理方面，百合有抗疲劳、抗肿瘤、降血糖等作用[2].近年来百合连作障碍日益严重，对百合的产量、品质及市场价格影响很大.而百合枯萎病是引起连作障碍的重要病害，对产量和质量造成不同程度损失[3].百合枯萎病也称根腐病、茎腐病，由致病性尖孢镰刀菌侵染引起的植物枯萎病是世界性的土传真菌病害之一[4]，也是百合病害中最严重、造成经济损失最大的病害之一.目前防治措施主要有农业防治、化学防治、生物防治[5].在大力倡导环境保护和食品安全的今天，生防发挥的作用越来越明显.目前已报道的对枯萎病具有拮抗效果的生防细菌主要为芽孢杆菌.贾熙超等[6]发现多粘类芽孢杆菌JNJX-2对棉花枯萎病有良好的生防效果；李晋等[7]发现暹罗芽孢杆菌ZJT2在正常土壤中该菌株对西瓜枯萎病病菌的防治效果高达100%.武志江等[8]报道了枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为东方百合枯萎病拮抗细菌；杨谢斌[9]分离筛选出对龙牙百合枯萎病有显著抑制作用的拮抗菌株枯草芽孢杆菌Y35.但目前有关百合枯萎病拮抗细菌为贝莱斯芽孢杆菌相关报道比较少.

本研究拟采用土壤稀释法和平板对峙法等方法，筛选和鉴定龙牙百合枯萎病病菌的拮抗细菌，利用Salkowski比色法和钼锑抗比色法测定拮抗细菌抗病能力、分泌IAA及其溶磷能力.获取具有拮抗和促生双重功能的优良菌株，并通过形态学和分子生物学鉴定其菌株，以期为百合尖孢镰刀菌的生防应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 百合植株根际土壤及病原菌

1)连根带土的挖取连作且健康的卷丹百合、龙牙百合和铁炮百合，将植株“抖根”后，用刷子将根上剩余的土壤轻轻刷下来，得到根际土壤，放在4 ℃的冰箱保存备用.

2)病原菌为实验室从龙牙百合发病的鳞片上分离纯化而来，为尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum.

1.1.2 培养基

PDA培养基、LB培养基[10]、King培养基、PKO无机磷培养基(pH=7.1)、孟金娜培养基(pH=7.2)[11].

1.2 方法

1.2.1 拮抗细菌的分离、纯化与筛选

1)菌株的分离：根际土壤样品菌株的分离采取土壤稀释法[12].10 g土样加90 ml无菌水，200 r/min振荡30 min，制成初始土壤悬浮液.分别稀释至10-3、10-4、10-5和10-6这4个梯度，取100 μL各质量浓度菌液分别涂布于添加重铬酸钾的LB培养基，3次重复，28 ℃培养2～3 d，记录菌株生长情况，挑取形态差异明显的单个菌落.

2)菌株的纯化：对形态差异明显的菌落进行纯化培养，纯化3～4次.

3)菌株的筛选：平板对峙法筛选出具有活性的菌株，观察和培养，并用革兰氏染色液试剂盒对其进行染色.

1.2.2 抗病能力的测定

将病原菌用5 mm打孔器制成菌饼倒接于PDA平板中央，活化1 d后，在病原菌左右两侧(距病原菌2.5 cm)接种待测菌.3次重复，以不接种待测菌为对照.28 ℃下培养7 d，观察病原菌的形态，记录抑菌带宽和抑菌率并判断有无抗菌活性[13].计算方式如下：

1.2.3 细菌分泌IAA特性测定

1)采用S2比色液[14]，其测定范围为5～200 μg/mL，超过100 μg/mL需要稀释.

2)IAA标准曲线的制作：将纯的3-IAA配置浓度为2，4，6，8，10，15，20，25，30，35，40，45，50 mg/L的IAA梯度标准溶液，溶液与S2试剂按1∶1体积混合，室温下避光放置30 min，分别测定各浓度标准液OD530(在波长530 nm下的吸光值)，以IAA浓度为横坐标，OD530值为纵坐标得到IAA标准曲线.

3)定量测定：采用Salkowski比色法.将培养12 d的培养液在4 ℃环境下，10 000 r/min离心15 min，取上清液4 ml加S2比色液4 ml，黑暗下静置30 min后，然后用紫外分光光度计测定OD530，在标准曲线上查出各待测菌液的IAA浓度.

1.2.4 溶磷能力的测定

将500 μL各菌株的菌悬液分别接种于PKO无机磷培养液和蒙金娜培养液中，每个处理3次重复，放置于28 ℃、160 r/min摇床上培养10 d.用pH计测定培养10 d后的各菌株培养液pH值的变化情况.培养10 d后加入无磷活性炭1 g，150 r/min震荡30 min.再将培养液在4 ℃环境下，15 000 r/min离心 15 min，取上清液用钼锑抗比色法测定有效磷增量[15].计算公式如下：

P=K×V/V1，

式中：P为有效磷增量；K为标准曲线上显色液的磷质量浓度(mg/L)；V1为显色时吸取上清液的体积(mL)；V为显色时溶液定容的体积(mL).

1.2.5 拮抗菌株分子生物学鉴定

将上述分离纯化得到的优良菌株进行DNA的提取，然后选用通用引物16s(27F/1492R)和专用引物gyrA(gyrA-R/gyrA-F)[16]进行基因序列扩增，扩增后的产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测得的序列利用MEGA 6.0软件进行聚类分析，进而初步鉴定出所分离的菌株.

2 研究结果

2.1 百合根际土壤拮抗细菌的形态特征

菌株来源于龙牙、铁炮、卷丹百合的根际土壤，通过土壤稀释法，共分离了200余株细菌，其中具有拮抗作用的菌株有5株，分别为：假35、J45、TP54、TP58、J67.对这5种细菌进行纯化培养，通过培养和观察，5株细菌菌落均为近白色(图1).其中J67、TP58、TP54为革兰氏阳性菌株，J45、假35为革兰氏阴性菌株(图2).

(a)TP58 (b)J67 (c)J 45 (d)假35 (e)TP54

(a)TP58 (b)J67 (c)TP54 (d)J45 (e)假35

2.2 拮抗细菌抗病能力

28 ℃培养7 d后，观察菌株与病原菌的抑菌情况(图3).测量各菌株平板里病原菌菌落的直径和病原菌菌落与各拮抗菌株的距离，计算其抑菌率和抑菌带宽(表1).5种拮抗细菌对病原菌(LD12)都有一定的抗病能力，抑菌率有所不同.其中J67的抗病能力最好，达到52.47%，TP54和TP58的抑菌率也在40%以上，显著高于假35和J45.

(a)J67 (b)TP58 (c)TP54 (d)J45 (e)假35

表1 各株拮抗细菌抑菌率和抑菌带

2.3 拮抗细菌分泌IAA的能力

定量测定时用Salkowski比色法，以IAA质量浓度为横坐标，OD530值为纵坐标，得到IAA标准曲线方程：

YOD530=0.040XIAA+0.014，(R2=0.998).

测得5株菌株分泌IAA的量为4.87～10.05 mg/L(图4)，其中TP54、TP58、J67分泌IAA量较多，分别为10.05，8.65，8.97 mg/L，显著高于假35和J45，说明此3株菌株有很好的促生作用.

图4 各株拮抗细菌分泌IAA测定结果

2.4 各菌株溶磷能力测定

微生物溶磷可以通过酶解作用和有机酸酸解作用，酸性物质可使磷酸盐溶解，但当菌株处于磷酸盐饥饿状态时，会合成碱性的磷酸酶[17].孟金娜培养基培养10 d后，对各菌株的有效磷进行测定，5株菌株中有效磷增量为0.35～0.89 mg/L(表2)，而PKO无机磷培养基培养10 d后，菌株的有效磷增量为0.32～1.17 mg/L(表3).无论是无机磷还是有机磷，有效磷增加量均较少，说明溶磷效果较差.假35在PKO无机磷培养基和蒙金娜培养基中pH有上升的趋势，其余菌株pH均下降.实验结果表明5株菌株中培养液pH变化与菌株有效磷增量没有很好的线性关系.

表2 各菌株在孟金娜培养液中 10 d后有效磷增量、pH值变化

表3 各菌株在PKO培养液中 10 d后有效磷增量、pH值变化

2.5 细菌分子生物学鉴定

通过对菌株抗病能力、分泌IAA能力的测定，最终筛选出了3株抗性活性菌株.使用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒分别提取这3株细菌的DNA，经通用引物16S和专用引物gyrA扩增后，对扩增片段进行回收.将回收的片段送至上海生工测序.测序得到J67、TP54和TP58分别为1 489，1 489，1 490 bp和940，934，929 bp 的片段.将所测的16SrDNA序列与NCBI数据库收录的序列进行基因比对和同源性分析，构建系统进化树(图5、图6)，确定分离的菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis).

3 小结与讨论

徐刘平等[18，19]发现拮抗细菌对病原菌可以起到抗生、与病原菌竞争营养以及寄生和降解植物病原菌细胞的能力，也可以分泌一些生长物质来促进植株的生长.宋文欣[20]等筛选出一株枯草芽孢杆菌可以同时产生纤维素酶、蛋白质酶和β-1，3-葡聚糖酶来抑制病原菌的生长，防治桑枝枯菌核病病菌效果达85.71%.本试验从铁炮百合和卷丹百合等根际土中分离到TP54、TP58、J67等菌株，对百合尖孢镰刀菌抑制作用较好，且具有分泌IAA和溶磷能力，通过形态学和分子生物学鉴定3个菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis，3个菌株具有较好的生防潜力，其作用机理有待进一步研究.

图5 TP54、TP58、J67基于16s序列采用最大拟然法构建的系统发育树

图6 TP54、TP58、J67基于gyrA序列采用最大拟然法构建的系统发育树

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