益母草注射液通过其生物碱成分上调Tie-2、VEGFR2和VEGF促进斑马鱼血管新生

李玉芝,宋肖敏婷,王雯雯,周欣雨,黎娅琳,任吉霞,曹治兴

(1.成都中医药大学 药学院、西南特色中药资源国家重点实验室,四川 成都 611137;2.聊城大学 生命科学学院,山东 聊城 252059)

0 引言

血管生成在生理和病理生理过程中起着至关重要的作用,它是胎儿发育、伤口愈合和肿瘤生长的重要基础[1,2]。促进血管生成也是一种潜在的治疗策略,其可通过增加氧和营养供应来促进受损或缺血性组织的修复[3]。促血管生成疗法有望用于治疗多种组织损伤和缺血性疾病,如外周和冠状动脉疾病、脑梗死、伤口愈合、严重肢体缺血和组织死亡,未来将有超过5亿相关患者将受益于该疗法[4-6]。

益母草(LeonurusjaponicasHoutt.)是一种草本植物,广泛分布于亚洲,包括中国、韩国、日本和柬埔寨,多被用于调节妇女月经过少,同时,益母草具有活血祛瘀之功效,具有缓解或消除冠心病缺血症状以及通过活血作用治疗心脏病等药理作用[7,8]。益母草注射液是益母草地上部分提取的生物碱制成,由中国成都第一制药公司研制。临床研究表明,益母草注射液单独使用或联合缩宫素都可有效的减少子宫收缩乏力和产后出血[9-11]。此外,益母草还被证明可以改善子宫缺血-再灌注损伤,增加子宫平滑肌的收缩强度和收缩频率[12]。因此,益母草注射液对组织损伤和缺血性疾病都具有一定的治疗作用。

本研究旨在研究益母草注射液的促血管生成活性,并通过鉴定主要生物碱来初步阐明其分子机制。结果发现益母草注射液可通过上调Tie-2、VEGF和VEGFR2来促进血管生成,其中葫芦巴碱和胆碱(益母草注射液的主要生物碱)是上调这些基因表达的关键成分。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

益母草注射液购自成都第一制药公司;水苏碱、胆碱和葫芦巴碱(纯度≥98%)购自成都MUST生物技术公司;将化合物溶解在DMSO(Sigma-Aldrich,St,Louis,MO)中配制25 mg/mL的母液浓度,然后加入到鱼水中以获得所需浓度;TRIzol试剂购自Invitrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德);iScript cDNA合成试剂盒和iQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad(Hercules,CA,USA)。

1.2 薄层色谱分离鉴定

益母草注射液样品稀释4倍,盐酸水苏碱(4.73 mg)溶于超纯水(4 mL),氢氧化胆碱(6.26 mg)溶于超纯水(4 mL),葫芦巴碱(5.81 mg)溶于超纯水(4 mL),流动相为EA + 95%乙醇 + H2O(1:18:24,v/v)的混合物。使用玻璃毛细管将样品点在硅胶板上,15 min后,将硅胶板从色谱罐中取出,用吹风机干燥,并在日光下使用Dragendorff's试剂+碘试剂进行显色观察。

1.3 HPLC-PAD分析

1.4 斑马鱼养殖

1.5 斑马鱼胚胎的采集和药物治疗方案

1.6 RNA提取和定量逆转录聚合酶链式反应

表1 QT-PCR引物表Table 1 QT-PCR Primer Table

1.7 数据统计

所有实验独立重复三次,每组使用15个胚胎,所有数据均表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。使用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比较检验,确定数据的统计显著性,p<0.05被认为具有统计学意义,使用GraphPad 5.0 Prism软件(GraphPad,San Diego,CA,USA)进行分析并可视化数据。

2 结果和讨论

2.1 HPLC/TLC检测益母草注射液主要成分

He等人通过大孔树脂/硅胶/Sephadex LH-20/重结晶从1.6 L益母草注射液中纯化了15种成分,包括20 g水苏碱、5 g胆碱和2 g葫芦巴碱[16]。通过HPLC-PAD和TLC分析,我们证实了水苏碱、胆碱和葫芦巴碱是益母草注射液的主要成分。HPLC-PAD结果显示,在242 nm的波长下,可检测到样品内两个峰(盐酸水苏碱占29.4%,葫芦巴碱占5.1%),它们出现在保留时间(tR)约为4 min的峰群中。此外,在柱上分离后,胆碱(占30.1%)在210 nm波长下,4.1 min左右出现。TLC图片显示,益母草注射液中胆碱是主要成分。

2.2 益母草注射液对斑马鱼血管损伤的影响

注:(a) 益母草注射液(242nm)的HPLC色谱图;(b) 盐酸水苏碱(242nm)的HPLC色谱图;(c) 葫芦巴碱(242nm)的HPLC色谱图;(d) 益母草注射液(210nm)的HPLC色谱图;(e) 氢氧化胆碱(210nm)的HPLC色谱图;(f) 薄层色谱图,从左到右依次为1葫芦巴碱、2盐酸水苏碱、3氢氧化胆碱、4益母草注射液。Note: (a) HPLC chromatogram of Matherwort injection injection samples(242nm); (b) HPLC chromatogram of Stachydrine hydrochloride(242nm);(c) HPLC chromatogram of Trigonelline(242nm); (d) HPLC chromatogram of Matherwort injection samples(210nm); (e) HPLC chromatogram of Choline hydroxide(210nm);(f)Thin layer chromatogram, from left to right, showing 1) Trigonelline 2) Stachydrine hydrochloride 3) Choline hydroxide 4) Leonurns japonieus injection samples.图1 益母草注射液的主要成分Fig. 1 The main components in Matherwort injection

2.3 益母草注射液内生物碱对斑马鱼血管损伤的影响

注:(a) 胚胎侧视图;(b) ISVs总长度量化图,与舒尼替尼组相比,*p <0.05,**p <0.01。Note: (a) Lateral view of embryos; (b) Quantification of total length of ISVs (n=15), Compared with the sunitinib group, * p<0.05, ** p<0.01.图3 葫芦巴碱、胆碱或水苏碱对化学诱导的血管生成损伤的影响Fig. 3 Effects of Stachydrine, Trigonelline or Choline on chemically induced angiogenesis damage

2.4 益母草注射液、葫芦巴碱、胆碱对Tie-2、VEGF和VEGFR2表达的影响

进一步通过QT-PCR检测血管生成相关基因的表达,以探究益母草注射液促血管生成作用的潜在机制。QT-PCR结果显示,益母草注射液可显著上调斑马鱼胚胎内Tie-2、VEGF和VEGFR2 mRNA表达,而不改变MMP-2或MMP-9 mRNA表达(图4)。同时,QT-PCR结果还表明,葫芦巴碱上调Tie-2和VEGF的表达,胆碱主要上调VEGF和VEGFR2的表达。因此,益母草注射液上调斑马鱼胚胎内Tie-2、VEGF和VEGFR2 mRNA表达,而葫芦巴碱和胆碱可能是其主要活性成分。

注:与对照组相比,*p <0.05,**p <0.01。Note: Compared with the control group, * p<0.05, ** p<0.01.图4 葫芦巴碱、胆碱、益母草注射液对Tie-2、VEGF、VEGFR2 mRNA表达的影响Fig. 4 Effects of Trigonelline, Choline and Motherwort injection on the expression of Tie-2, VEGF and VEGFR2 mRNA

3 结论

血管生成对机体是一把双刃剑。一方面,血管生成不足会影响组织的营养供应,导致缺血性疾病,如冠心病、心肌梗死、脑血栓等;另一方面,过度的血管生成会促进糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病的发展[13-16]。目前,许多抗血管生成药物,如sorafenib和Razumab,已被用于肿瘤和年龄相关性黄斑变性等疾病的治疗[17,18]。然而,目前仍缺乏促血管生成药物来治疗缺血性疾病。

在中医学中,血瘀证的症状和发病机制与缺血密切相关。中药成分对血瘀有许多治疗作用,包括抗血栓、抗凝血剂和内皮细胞保护剂。近年来,许多用于治疗血瘀的中药和提取物已被证明可促进血管生成,如川芎、丹参和当归[19-21]。益母草在临床上应用于血瘀证已有多年历史。在本研究中,我们证明了益母草注射液可以减轻化学诱导的斑马鱼血管损伤,并证明葫芦巴碱和胆碱是益母草注射液促进血管生成的主要活性成分。因此益母草注射液具有明显的促进血管生成的作用,益母草对血瘀证的作用可能与其促进血管生成的作用有关。

血管生成是一个复杂的生物学过程,包括已有血管的萌发、分支和分化生长,以及在组织中形成更成熟的血管网络[22]。许多促血管生成因子和细胞因子参与促进血管生成,其中,VEGF、VEGFR2和Tie-2是血管生成过程中内皮细胞增殖、迁移和分化的重要信号转导蛋白[23,24]。同时,MMPs(基质金属蛋白酶)分解ECM(细胞外基质)并促进内皮细胞的迁移,在血管生成中主要发挥侵袭作用[25]。在本研究中,我们证明益母草注射液及其两种主要成分(葫芦巴碱和胆碱)可以显著上调Tie-2、VEGF和VEGFR2的表达,而不调节MMPs的表达。由此可见,益母草注射液只促进血管生长,而不会引起侵袭。

综上所述,益母草注射液的主要生物碱成分为水苏碱、胆碱和葫芦巴碱。我们证明益母草可以通过上调血管生成基因Tie-2、VEGFR2和VEGF的表达来促进血管生成,而这种作用可能源于葫芦巴碱和胆碱的生物活性。