O-GlcNAc糖基化修饰的研究进展

王梦荷,郑 路,孟领航,王佳佳

(河南大学 抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室,河南 开封 475000)

0 引言

O-GlcNAc糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰的主要形式之一。根据糖链的连接方式不同,蛋白质的糖基化可以分为N-糖基化、O-糖基化、C-甘露糖化以及糖基磷脂酰肌醇间接连接的糖基化,其中O-糖基化和N-糖基化修饰是最广泛的两种方式[1]。

O-GlcNAc糖基化是将O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖与细胞内蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基相结合的一种翻译后修饰(图1)。O-GlcNAc糖基化与蛋白质的O-磷酸化修饰方法类似,都是对蛋白质丝氨酸和苏氨酸残基的侧链羟基进行修饰,但这两种修饰方式对底物的特异性识别机制完全不同。与磷酸化众多的激酶和磷酸酶协同参与不同,O-GlcNAc糖基化动态循环仅由一对酶在体内参与:O-GlcNAc转移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)和O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase, OGA)[2]。O-GlcNAc糖基化修饰的独特之处在于:(1) 只发生于细胞核和细胞质中;(2) 参与修饰的结构仅由GlcNAc单糖修饰,不会形成复杂的糖链结构;(3) 是一种可逆的、可诱导的、动态的翻译后修饰。细胞内O-GlcNAc糖基化的糖基供体尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)是氨基己糖生物合成途径(Hexosamine biosynthesis pathway, HBP)的产物,OGT将UDP-GlcNAc转移到目标蛋白底物的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上,而OGA催化将其去除[3]。研究发现这种形式的胞内蛋白糖基化几乎调节所有细胞生命活动过程,包括转录翻译、信号转导、调节蛋白质间相互作用以及蛋白质的定位等。另外UDP-GlcNAc的合成也需要细胞内某些营养物质,如氨基酸,核苷酸和脂肪酸等,同时也有研究发现OGT的酶活性和O-GlcNAc糖基化水平主要取决于糖基供体UDP-GlcNAc的多少,所以O-GlcNAc被看作是体内细胞营养物质代谢的感受器[4]。

注:进入细胞的小部分葡萄糖经过氨基己糖生物合成途径(HBP)生成UDP-GlcNAc,在OGT催化下将UDP-GlcNAc转移到目标蛋白底物的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上,如对细胞骨架,线粒体,SNAP、组蛋白等修饰;O-GlcNAc糖基化和磷酸化一样是常见的蛋白质翻译后修饰,参与信号传导,影响蛋白质的结构,调控修饰蛋白质的生物学功能。Note: A small portion of glucose entering the cell undergoes the aminohexose biosynthesis pathway (HBP) to generate UDP-GlcNAc, which is then transferred to the hydroxyl group of serine or threonine residues in the target protein substrate by OGT, such modifications include the cytoskeleton, mitochondrion, SNAP, and histone, etc.; O-GlcNAcylation, as similar with phosphorylation, is a common post-translational modification of proteins, involving in signals transduction, affecting the structure of proteins, and regulating the biological functions of the modified proteins.图1 O-GlcNAc的生物合成途径和细胞内修饰Fig. 1 Biosynthetic pathway of O-GlcNAc and its modification in intracellular

1 O-GlcNAc糖基化修饰的生理及病理意义

1.1 O-GlcNAc糖基化修饰的生理学作用

1.1.1 参与基因转录调节。O-GlcNAc糖基化在基因转录翻译过程中发挥了重要的作用,可通过修饰与转录相关的蛋白质调节其转录活性。O-GlcNAc可修饰RNA聚合酶II和基础转录复合物,也可直接调控多种转录因子的活性,包括Sp1、雌激素受体、STAT5(信号转导和转录激活因子5)、p53、YY1(阴阳1)、CREB(cAMP反应元件结合)等。除了直接调节转录外,O-GlcNAc还在介导表观遗传学中发挥着重要作用。例如,有研究表明组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)可发生O-GlcNAc修饰。此外,许多表观遗传调控因子本身存在O-GlcNAc修饰或与OGT/OGA相关[5]。转录因子Sp1(transcription factor 1)作为一种DNA结合蛋白,具有序列特异性,可调控某些含有GC/GT序列的启动子的核病毒基因转录过程和多种机体生理以及病理过程。机体在缺乏营养的情况下,Sp1可以发生去糖基化最终导致蛋白酶体降解,这一过程使依赖于Sp1表达的基因转录水平下调[6]。

1.1.2 调节细胞周期。在细胞周期进程中,O-GlcNAc糖基化水平在不同阶段有所波动[7],O-GlcNAc糖基化是一种单糖修饰,由于其不局限于细胞表面和分泌蛋白,可作为蛋白质的翻译后修饰参与减数分裂进程,并在衰老过程中驱动精细胞发生损害,O-GlcNAc的扰动也会损害雌性配子的发生。OGA破坏导致的O-GlcNAc糖基化水平升高会导致胚胎有丝分裂缺陷,包括胞质分裂失败、染色体滞后和双核等[8]。有研究表明,某些癌细胞系中的OGT抑制导致细胞增殖减少而不诱导细胞死亡,这可能是由于诱导了细胞周期阻滞。综上所述在细胞周期的有丝分裂和减数分裂过程中,维持O-GlcNAc稳态具有重要意义[9]。

1.1.3 参与蛋白质调节。O-GlcNAc糖基化修饰可以提高蛋白质的稳定性。O-GlcNAc糖基化修饰大多数位于与蛋白质相关的PEST序列上,O-GlcNAc糖基化通过修饰该序列可抑制靶蛋白的降解,从而提高蛋白质的稳定性。有文章报道O-GlcNAc糖基化修饰在调节稳定蛋白质方面的另一种临床应用:O-GlcNAc糖基化在某些情况下能够产生较高的cAMP信号。这种单糖使人体血清中胰高血糖素样肽-1(GLP-1)在体外的降解速度比未经修饰的多肽减慢了两倍左右,显著改善了机体对葡萄糖的代谢。O-GlcNAc糖基化修饰可以在体外增加血清中甲状旁腺激素(PTH)的半衰期,提高PTH在体内的活性和稳定性,我们可以推测O-GlcNAc糖基化修饰同样可用于其他类型的多肽[10]。

1.1.4 介导应激反应。大量研究表明,动态的蛋白质O-GlcNAc糖基化是一种保守的细胞内信号机制,可被多种应激源激活,在急性应激前后,提高细胞O-GlcNAc水平具有一定的保护作用,而降低细胞O-GlcNAc水平可产生损害[11]。O-GlcNAc在5000多种蛋白质中参与修饰,以响应各种影响蛋白质功能的刺激,这与心血管疾病和神经衰退性疾病密切相关。有研究表明O-GlcNAc转移酶(OGT)可发挥应激传感器的作用,在抑郁症患者中,OGT mRNA增加,选择性删除星形胶质细胞OGT产生抗抑郁样作用,内侧前额叶皮层(mPFC)中的星形细胞OGT通过谷氨酸转运体-1(GLT-1)的O-GlcNAc糖基化调节抑郁样行为[12]。

1.1.5 参与免疫调节。O-GlcNAc在免疫系统中发挥重要作用。研究发现O-GlcNAc糖基化可以促进T细胞和B细胞的发育、增殖和活化,调节巨噬细胞的炎症和抗病毒反应,促进活化的中性粒细胞的功能,抑制自然杀伤细胞的活性[13],并可作为糖尿病和胰岛素抵抗的促炎介质[14]。由于蛋白质磷酸化在调节先天免疫信号传导的许多方面起着重要作用且O-GlcNAc糖基化修饰与磷酸化存在相互拮抗或相互促进的阴阳关系,越来越多的证据表明,参与NF-kB通路和其他炎症相关信号通路的蛋白质的O-GlcNAc糖基化在调节先天免疫细胞的功能中起着重要作用[15]。

1.2 O-GlcNAc糖基化修饰与疾病的关系

1.2.1 Ⅱ型糖尿病(diabetes mellitus type 2, T2DM)。又称非胰岛素依赖型糖尿病,是一种慢性代谢缺陷性疾病,患者特征为高血糖,胰岛素水平正常。研究发现胰岛素可通过其受体使OGT磷酸化,从而提高OGT的活性,OGT的活性与Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病有关。在Ⅱ型糖尿病中,矿化皮质激素受体(Mineralocorticoid Receptor, MR)的O-GlcNAc糖基化可直接增加高糖条件下受体的蛋白质水平和转录活性[16]。此外,O-GlcNAc糖基化被认为是一个重要的营养传感器,能够调节广泛生理反应过程,在妊娠糖尿病中,胎盘滋养细胞生长激素分泌过多,OGT的下调可能有助于胰岛素抵抗[17]。

1.2.2 神经退行性疾病(neurodegenerative disease, ND)。ND是一类慢性进行性大脑和脊髓的细胞神经元退行性变性、减少而导致的疾病的总称。包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症等。在神经系统的发育过程中,O-GlcNAc对神经元的正常发育和功能起着关键作用,这对于建立营养感知功能失调与早期神经系统疾病之间的联系至关重要[18]。脑糖代谢受损被认为是脑功能障碍和神经变性的标志,氨基己糖生物合成途径(HBP)代谢失调和O-GlcNAc异常循环与神经元疾病的诱导或进展有关[19]。与其他器官相比,大脑的O-GlcNAc糖基化程度更高,O-GlcNAc糖基化修饰水平异常与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)密切相关。阿尔茨海默病的特征包括淀粉样斑块和神经原纤维tau缠结。Tau是一种调节神经元细胞骨架稳定性的微管结合蛋白,在阿尔茨海默病中,tau蛋白异常磷酸化,并积聚成有毒的神经原纤维缠结。神经组织中OGT缺失会增加tau蛋白的过度磷酸化,慢性药物抑制OGA可减少病理性tau。tau蛋白的O-GlcNAc糖基化使其不聚集。其中过度磷酸化的tau与tau的O-GlcNAc糖基化呈反比[20]。

1.2.3 肿瘤。许多肿瘤细胞表现出糖酵解增强和线粒体代谢抑制,这种现象被称为“Warburg”效应,对肿瘤的发展至关重要[21]。患者肿瘤组织中OGT高表达,OGA低表达,并出现高水平的O-GlcNAc糖基化[22]。在起源于B细胞前体的急性淋巴细胞白血病中,增殖前B细胞阶段的O-GlcNAc糖基化修饰显著,通过抑制其修饰下调c-myc的表达。大量研究证明依赖于O-GlcNAc糖基化修饰表达的c-myc是调控前B细胞增殖的重要组分,也是治疗前急性淋巴细胞白血病的关键靶点[23]。

2 O-GlcNAc糖基化蛋白的富集和鉴定

O-GlcNAc在细胞调控蛋白质中广泛存在,但由于其化学计量低且富集效率有限,且O-GlcNAc糖基化肽离子信号会被大量的未修饰的离子信号掩盖而被抑制,其功能研究落后于其他翻译后修饰(PTMs)[24]。从蛋白质组学的角度发展的富集和定量技术,结合质谱(MS)进行大规模的O-GlcNAc分析,这使鉴定更多糖基化蛋白和糖基化位点成为可能(图2)。

图2 检测O-GlcNAc修饰的各种标记策略Fig. 2 Various strategies to detect O-GlcNAc modifications

2.1 抗体和凝集素富集法

抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。O-GlcNAc抗体是为特定的糖基化表位生产的,目前常用的特异性抗体有两种:一种是利用合成的O-GlcNAc糖基化RNA聚合酶II C端重复片段作为免疫原而开发的IgM类抗体,如CTD110.6,一种是针对O-GlcNAc修饰的糖基化核孔蛋白片段的IgG型抗体,如RL2[25]。但是这些抗体的亲和力较低、特异性有限,在许多情况下只能用于多个修饰的,分子量大的蛋白质。除了最常见的这两种,市售的还有将近200种O-GlcNAc抗体,这些抗体具有表位特异性或存在对高富集蛋白和低富集蛋白的选择性,因此存在一定局限性[26]。可通过对O-GlcNAc糖基化蛋白进行富集或使用抗体组合提升适用性。

除了抗体,一些植物凝集素,如小麦胚芽凝集素(Wheat germ agglutinin, WGA),蛋白质的多个位点O-GlcNAc修饰可以增强WGA与单糖的亲和力,便于更有效的分离,但WGA对GlcNAc结合力较弱。Vosseller等人开发了一种凝集素弱亲和色谱法(LWAC),通过从神经元突触后富集到145个特异O-GlcNAc糖基化肽,鉴定出了63个蛋白肽段[27],以及Liu团队报道了一种AANL凝集素,是一种富集和鉴定O-GlcNAc糖基化蛋白和肽新工具[28]。

2.2 化学酶标记富集法

化学酶法标记富集蛋白策略通常需要两步,首先GalT(Y289L)将UDP-GalNAz选择性共价修饰天然存在的O-GlcNAc糖基化蛋白的GlcNAc部分,然后通过碘化亚铜介导的叠氮烷基环加成(CuAAC)反应进一步富集O-GlcNAc糖基化蛋白[29]。浙江大学易文课题组开发了一种一步化学酶标记策略,利用GalT突变体开发了O-GlcNAc糖基化分析策略,该策略用(GalT-K279A)直接将UDP-GalNAbiotin共价连接到O-GlcNAc糖基化蛋白,与传统的两步酶标记法相比,一步化学酶标记法对O-GlcNAc糖基化蛋白的富集和分析灵敏度更高[30]。目前的化学酶标记方法不可避免地在糖肽上引入了庞大的标签(大多数为300 kDa),对鉴定效率产生了负面影响,理想的化学酶方法应该能够特异性地富集O-GlcNAc糖基化肽,且不引入庞大的标签。有研究报道了一种可逆的O-GlcNAc糖基化肽的化学酶标记策略,其中O-GlcNAc部分被Endo-M N175Q延长,酶加的聚糖在HILIC富集后进一步被Endo-M/S WT去除。与基于GalT突变体的方法相比,该方法操作方便,避免了笨重标签对糖肽鉴定的干扰[31]。

2.3 β消除反应法(BEMAD)

BEMAD法是利用DTT的解双键作用,选择性富集O-GlcNAc修饰的蛋白质,使其分子质量增加,准确鉴定O-GlcNAc修饰位点。由于O-GlcNAc糖苷键容易受到碱的影响产生β消除,丝氨酸和苏氨酸位点失去水分子,提供了修饰位点信息。BEMAD法是指将蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基上的O-GlcNAc糖基化修饰在碱性条件下进行β消除反应,在α碳和侧链碳原子之间形成不饱和双键,然后与二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)发生米氏加成反应,它可以打开双键来标记被β消除的O-GlcNAc位点,同时,DTT上的巯基可以与硫醇形成二硫键,常用于O-GlcNAc糖基化修饰多肽的富集和修饰位点的鉴定[32]。但O-GalNAc等其他翻译后修饰也会发生BEMAD反应而产生假阳性,需要加入样品处理或者采用对照实验等方法以降低假阳性的影响。

2.4 硼酸法

硼酸法被用于糖蛋白或糖肽富集,是因为它能够与含顺式二羟基的糖类(例如甘露糖、葡萄糖和半乳糖)发生共价且可逆的化学反应,进而形成稳定的五边形化合物。利用硼酸高亲和力可以捕获N-糖肽和O-糖肽,硼酸识别聚糖是非特异性的,即可以识别有各种分支的聚糖、线性聚糖以及单糖,便于样品分析。常用的硼酸化合物有3-氨基苯硼酸(APBA)和4-乙烯基苯硼酸(VPBA)。APBA被包裹在磁性氧化铁纳米颗粒上,具有极好的结合能力和选择性,可选择性捕获糖蛋白[33]。

2.5 肼化学法

在肼化学法中,聚糖的顺式二羟基被高碘酸盐氧化,然后与固定有酰肼基团的树脂发生共价偶联。糖蛋白的酰肼捕获之后需要进行蛋白的水解消化、非糖肽的去除洗涤和利用PNGase F释放 N 聚糖。与凝集素亲和法相反,酰肼捕获是非特异性的,可以富集所有糖缀合物。肼化学促进了糖蛋白组学,这种被称为“反向糖蛋白印迹”的方法也被用于富集SGP,当富集SGP时,唾液化的糖蛋白被高碘酸盐氧化,捕获在肼珠上,后进行胰蛋白酶消化,并通过SAs的酸水解释放。基于肼化学的方法虽然具有较高的SGP富集选择性,但却丢失了末端SAs的信息[34]。

2.6 代谢标记富集法

代谢标记法是指将具有叠氮基等特殊修饰基团的GlcNAc类似物,即代谢化学报告(Metabolic chemical reporters, MCRs)通过细胞培养进入代谢途径,转化成UDP-GlcNAc类似物,进而在糖基转移酶OGT的催化下发生O-GlcNAc糖基化修饰的过程(图3),常用的代谢标记基团有酮基、叠氮基、巯基等。叠氮基可通过Staudinger反应与炔基发生特异性化学反应以引入生物素等,且叠氮基与炔基的反应特异性强,叠氮基团小,对代谢类似物稳定性的影响较小,从而得到广泛应用[35]。代谢标记的一个限制是,它与内源性的UDP-GlcNAc合并竞争,对UDP-GlcNAz等类似物的利用率较低,代谢类似物在细胞代谢过程中可能标记其他糖修饰,产生假阳性[36]。

注:含有叠氮基或炔基等生物正交基团的代谢化学报告基团(MCRs)处理细胞后,裂解物与可断裂生物素DADPS炔反应,然后进行链亲和素富集和胰蛋白酶消化,去除未修饰的肽后,释放所需的糖肽并收集用于LC-MS/MS分析。Note: After treatment of cells with metabolic chemical reporters (MCRs) containing bioorthogonal groups such as azide or alkynyl groups, the lysates are reacted with the cleavable biotin DADPS alkyne, followed by streptavidin enrichment and tryptic digestion, and after removal of unmodified peptides, the desired glycopeptides are released and collected for LC-MS/MS analysis.图3 代谢标记富集O-GlcNAc糖修饰蛋白的流程图Fig. 3 Flow chart of metabolic labeling enrichment of O-GlcNAcylated proteins

2.7 亲水作用液相色谱法(Hydrophilic interaction chromatography,HILIC)

亲水作用液相色谱是一种传统的糖肽富集方法。该方法使用亲水材料(如胺、酰胺或齐聚物键合硅胶)来捕获连接在糖肽上的亲水糖链。这样,糖肽就可以以较高的特异性富集。为了尽可能排除大量N-糖蛋白对O-GlcNAc糖基化肽富集和鉴定的干扰,在O-GlcNAc糖基化肽富集之前,应先用PNGaseF和O-糖苷酶去除N-聚糖和O-聚糖[37]。有报道称一种接枝一氧化氮基团的材料,可从天然蛋白质中对O-GlcNAc糖基化肽进行高亲和力富集,对来自PNAC-1细胞的O-GlcNAc糖基化蛋白进行了位点特异性分析,从183个糖蛋白中新发现了197个O-GlcNAc位点[38]。此法可与凝集素亲合技术结合利用凝胶电泳进行糖肽的分离富集,这种方法利用了加入糖链可使其亲水性增强的原理[39]。但此法无法区分肿瘤组织中含量很高的O-GalNAc糖基化蛋白,还需要进一步严格评估。

3 用于富集O-GlcNAc糖基化蛋白的MCRs

MCRs已被证明是一种利用功能探针在活细胞和各种生物体上标记聚糖的有效方法。其原理是通过生物正交官能团修饰的单糖类似物,如叠氮基或炔基,使其被细胞吸收,并通过救助途径酶转化为相应的核苷酸糖供体,最终并入多糖结构中[40]。之后将通过生物正交反应与荧光染料或生物素反应,以实现O-GlcNAc糖基化可视化或亲和纯化[41]。下面将系统介绍近年来已报道的常用于O-GlcNAc糖基化蛋白富集和位点鉴定的MCRs(图4)。

图4 已报道的HexNAc类似物用于O-GlcNAc糖基化蛋白富集Fig. 4 Reported HexNAc analogues for O-GlcNAcylated proteins enrichment

3.1 GlcNAc类似物

3.1.1 Ac4GlcNAz:由Bertozzi团队研究合成,是第一个被证明可以经GlcNAc挽救途径转化为UDP-GlcNAz,通过OGT转运实现对目的蛋白的糖基化修饰。该探针的开发和应用为O-GlcNAc糖基化修饰的可视化鉴定提供了一个有效的工具,但是由于GlcNAc挽救途径中存在一个限速酶:UDP-GlcNAc焦磷酸化酶,致使GlcNAz代谢标记效率较低。受限于GlcNAz的标记效率,对其他GlcNAc类似物的研究也在不断推进[42]。

3.1.2 Ac42AzGlc:Pratt等开发了2-叠氮-2-脱氧葡萄糖(2AzGlc),用过乙酰化的Ac42AzGlc处理细胞后,发现2AzGlc不标记细胞表面的糖蛋白,只标记细胞内的蛋白质和跨膜蛋白,由于不能受OGA调控动态地从蛋白质底物上去除,积累的高浓度2AzGlc对细胞有一定的毒性。2AzGlc是第二个被表征为对O-GlcNAc糖基化修饰具有选择性的MCR。并且进一步突出了OGT底物的多样性,2AzGlc的研究对天然的非乙酰氨基葡萄糖单糖对细胞内修饰蛋白质标记具有重要的意义[43]。

3.1.3 Ac46AzGlc:先前的研究表明除了GlcNAc外,OGT还可以利用多种天然和非天然单糖对蛋白质进行酶修饰。为了研究细胞新陈代谢生物合成酶和糖基转移酶对不同糖的耐受性方面的作用,Partt等开发了6-叠氮-6-脱氧葡萄糖(6AzGlc)。研究表明6AzGlc处理细胞可以代谢标记O-GlcNAc修饰的细胞内蛋白质,值得注意的是OGT能够在体外接受UDP-6AzGlc作为底物,将6AzGlc转移至糖蛋白上,并且大部分是O-连接的蛋白质。这种标记不依赖于6AzGlc到6AzGlcNAc的转换,因为敲除转换中负责决定效率步骤的酶GFAT不会导致标记的减少。6AzGlc的研究开发对OGT作为除UDP-GlcNAc之外的多种糖基供体的代谢转化具有重要的意义,使得MCRs在糖蛋白分析中的应用更为广泛[44]。

3.1.4 Ac36AzGlcNAc:Partt等以6AzGlcNAc为基础合成了乙酰化的GlcNAc类似物Ac36AzGlcNAc并与多种哺乳动物细胞共同孵育。由于6位羟基被叠氮基取代,所以不能通过GlcNAc补救途径转化为UDP糖基供体,但研究发现当将正常底物GlcNAc-6-磷酸添加到反应混合物中时,AGM1能够将6AzGlcNAc磷酸化为6AzGlcNAc-1-p,继而转化为UDP-6AzGlcNAc。为了进一步研究6AzGlcNAc的特异性,用6AzGlcNAc进行标记富集蛋白质后,鉴定出不含外源添加到分泌途径中的聚糖(N-连接的或粘蛋白O-连接的)修饰的细胞内蛋白质,这证实6AzGlcNAc对O-GlcNAc糖基化蛋白质具有高度特异性[45]。

3.1.5 Ac34dGlcNAz:Peng George Wang等开发合成了1,3,6-三乙酰基-2-叠氮-2,4-双脱氧-D-吡喃葡萄糖(Ac34dGlcNAz),它可以通过GalNAc挽救途径,经OGT转移到细胞内蛋白质上。由于C4位缺少羟基,因此Ac34dGlcNAz比以前的探针具有更高的选择性。此外,O-4dGlcNAz修饰对OGA具有较强的耐受性,大大提高了Ac34dGlcNAz的代谢标记效率。总而言之,该探针在标记、富集和鉴定细胞中的O-GlcNAc糖基化蛋白方面是一种更有效和更特异性的工具[46]。

3.1.6 Ac4GlcNAlk:GlcNAlk是炔基基团修饰的GlcNAc类似物,Ac4GlcNAlk可以在低糖条件下成功地标记到蛋白质中。Pratt等开发合成了Ac4GlcNAlk,研究表明GlcNAlk可以通过GlcNAc的补救途径。先前的研究证明GlcNAz可以代谢相互转化为GalNAz,而GlcNAlk不能,进而能更专一的代谢标记O-GlcNAc糖基化蛋白。利用GlcNAlk标记后富集细胞糖蛋白,质谱鉴定出了374个蛋白质,其中279个是以前没有报道过的,同时验证了泛素连接酶NEDD4-1可以发生O-GlcNAc糖基化修饰,这是首次报道NEDD4-1的糖基化修饰[47]。

3.1.7 Ac36AlkGlcNAc:Pratt等开发了一种新型的探针Ac36AlkGlcNAc,与之前报道过的Ac36AzGlcNAc相比,对细胞表面糖蛋白具有更高选择性且可在短时间内完成对O-GlcNAc糖基化蛋白质特异性标记。Ac36AlkGlcNAc不能通过GlcNAc补救途径在细胞内代谢为UDP-6AlkGlcNAc,但是与Ac36AzGlcNAc类似,磷酸乙酰葡萄糖氨变位酶能将6AlkGlcNAc磷酸化为6AlkGlcNAc-1-p。同时也利用该探针在半胱天冬氨酸蛋白酶中鉴定出了469种O-GlcNAc糖基化蛋白,并且半胱天冬氨酸蛋白酶活性的调节与O-GlcNAc糖基化修饰有关,这种修饰在调节细胞的发育和疾病进程的程序性凋亡中发挥重要作用。因此,Ac36AlkGlcNAc探针的应用使半胱天冬氨酸蛋白酶的O-GlcNAc糖基化可视化成为可能[48]。

3.2 GalNAc类似物

3.2.1 Ac4GalNAz:Bertozzi等开发研究了N-叠氮乙酰半乳糖胺(GalNAz),利用Ac4GalNAz对胞质和胞核内的O-GlcNAc糖基化蛋白质进行代谢标记。它可以通过GalNAz补救途径产生UDP-GalNAz,在GALE的作用下UDP-GalNAz转化为UDP-GlcNAz。Ac4GalNAz同时经过GalNAz或GlcNAz挽救途径产生的多糖可能会使Ac4GalNAz标记的细胞表面糖蛋白的研究复杂化。然而,从膜结合的粘蛋白类型糖蛋白中提纯核蛋白和细胞质蛋白可以对O-GlcNAc修饰本身进行特定的检测。这说明Ac4GalNAz是对O-GlcNAc糖基化蛋白代谢标记强有力的MCR。另外GALE可以调节细胞内UDP-GalNAz和UDP-GlcNAz的浓度,这可能表明GALE差向异构酶在细胞生理学中发挥了意想不到的作用,或许还能在疾病中发挥作用。因此,GALE的动力学和细胞生物学特性将成为未来研究的一个有趣的课题[49]。

3.2.2 Ac36AzGalNAc:J.Li等报道了一种含有C6叠氮化合物的非天然单糖Ac36AzGalNAc,研究发现它可以有效地标记多种细胞内蛋白质。与先前报道的GlcNAz和GalNAz探针相比,Ac36AzGalNAc与N-糖基蛋白/O-糖基蛋白的结合较少,表明它是一种更特异的O-GlcNAc修饰代谢探针,且具有很高的标记效率和特异性。此外,基于LC-MS/MS蛋白质组学分析,利用Ac36AzGalNAc鉴定出了964个蛋白质,包括许多重要的潜在O-GlcNAc底物。Ac36AzGalNAc作为高效和特异的代谢探针,已经被用于O-GlcNAc糖基化蛋白的检测和鉴定,这将为O-GlcNAc糖基化修饰功能的研究提供新的思路[50]。

3.2.3 1,3-Pr2GalNAz:Hao等报告了新一代非天然单糖,它可以被细胞高效率地吸收,更重要的是不会诱导非特异的S-糖基化副反应。1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz具有非常高的代谢标记效率,不会引起S-糖基化修饰的同时也不具有细胞毒性,但研究发现1,3-Pr2GalNAz比1,3-Ac2GalNAz具有更高的特异性和效率,1,3-Pr2GalNAz是一种更好的新一代非天然糖的探针。该探针的发现为改善非天然糖标记物,避免S-糖基化提供了无限可能[51]。

3.2.4 Ac4GalCCp:Patterson通过将相应的氨基糖与活化的环丙烯(Cyclopropenes, CCp)单元直接结合,合成了所需的探针(Ac4GalCCp)。实验发现环丙烯糖的功能与叠氮类探针相似,与Ac4GlcNAz相比,Ac4GalCCp可以更好的靶向标记O-GlcNAc糖基化蛋白。近年来,环丙烯类化合物广泛应用于生物分子可视化和鉴定方面,并且环丙烯糖可以与叠氮化合物、炔类化合物同时使用,环丙烯探针的多功能性的研究将推动聚糖和相关生物分子的多组分成像实验技术的发展[52]。

4 问题与展望

从1983年首次发现O-GlcNAc糖基化修饰以来,大量的研究证明O-GlcNAc糖基化影响细胞转录、信号分子传导和物质代谢等生命进程。很多重大疾病的发生发展与该修饰有密切联系。为了帮助检测O-GlcNAc修饰,人们研究的检测技术和非天然的小分子探针对O-GlcNAc糖基化蛋白的鉴定发挥了重大的作用。虽然现有的分子探针对O-GlcNAc糖基化标记已展现出良好的效率和特异性,但有些仍不能完全避免非特异性的干扰[53]。未来需要更好的利用已报道的探针开发出更高效率和特异性的探针,以促进O-GlcNAc修饰的研究和应用。

尽管在过去的几年里对O-GlcNAc修饰的研究已经取得了很大的进展,但许多问题仍未得到解决。因此,研究更有效的化学功能基团与探针表位之间的生物正交反应,来检测低丰度的O-GlcNAc糖基化蛋白,对于病理相关蛋白质的O-GlcNAc糖基化的生理功能和某些糖代谢途径中的相关酶的探索至关重要。关键蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的检测作为治疗癌症靶点以及靶向药物的研发将为人类抗肿瘤提供强有力的支持[54]。