基于适配体-抗体杂交用于干扰素-γ的SERS高灵敏检测

金伽利,陈燕,杨丹婷*

(1.宁波大学医学院公共卫生医学院,宁波 315211;2.宁波大学附属李惠利医院,宁波 315000)

1 引言

细胞因子是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)经刺激而合成和分泌的低分子量可溶性蛋白质,是身体功能状态的核心指标[1],是机体产生炎症反应时的重要标志,在血细胞生成、细胞生长分化、组织损伤修复和细胞间通讯等许多生理方面发挥着重要的生物学功能[1,2],其作为生物标记物,可用于疾病的预防、诊断及治疗效果检测。干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)是重要的细胞因子之一,自1965年发现[3]以来就广受关注。其主要由自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)和活化的T淋巴细胞分泌,在免疫细胞的活化和分化中起重要的调节作用[4]。但当IFN-γ在体内过量堆积时,会引发炎症反应,在一定程度上造成神经元损伤[5]。因此,对IFN-γ进行快速准确的超灵敏检测具有重要意义。

目前针对IFN-γ的常用检测方法主要有干扰素-γ释放试验(interferon-γ release assays, IGRA)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、酶联免疫斑点技术(Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISPOT)等[6,7]。这些方法都具有较高的特异性,但是存在价格昂贵、用时久、操作繁琐等缺陷[6]。因此,开发一种简单快速、灵敏度高的IFN-γ检测方法很有必要。表面增强拉曼散射(surface enhancement of Raman scattering, SERS)因其独特的指纹光谱、较高的灵敏度、良好的特异性、出色的信号放大作用,已被广泛应用于免疫测定、疾病诊断等领域[8]。Zengin等人设计了一种针对Tau蛋白的双抗体夹心结构用于SERS检测[9]。他们将单克隆抗体功能化的混合磁性纳米颗粒和多克隆抗体修饰的金纳米颗粒分别作为捕获探针和检测探针。实验结果表明三明治结构的应用大大提高了灵敏度和选择性,检测限低于25 fM。Gu等人探索出了一种针对SARS-CoV-2的双适配体传感器[10]。该传感器将刺突蛋白适配体与固定在Au膜上金纳米粒子偶联作为SERS基底,又将刺突蛋白适配体与被拉曼报告分子IR-808修饰的金纳米粒子偶联作为SERS探针,实现了超灵敏检测。其约12 min即可检测到检测限低于0.7 pg/mL的刺突蛋白和检测限为0.8 TU/mL的假病毒。

目前研究发现,与仅基于适体和仅基于抗体的生物传感器相比,抗体-适配体的杂交三明治结构的应用具有更高的灵敏度、亲和力、稳定性和选择性,更广的线性响应范围,面对复杂的检测环境具有更大的优势[11-14]。Bai等人开发了一种定量检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)的高特异性酶联杂交夹心测定法(ELHSA),通过构建“捕获抗体-靶标-检测适配体”的三明治结构,基于辣根过氧化物酶(HRP)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色原理,实现了对cTnI的快速检测,检测限低至0.24 ng/mL[15]。Seiler等人探索出了一种新型的适体-抗体杂交侧流分析(hybrid-LFA)用于高效检测尿液中的CXC 趋化因子配体 9 (CXCL9)以评估肾移植后的慢性抗体介导的排斥反应(AMR),在PBS溶液和实际样品中的检测限可分别达10 pg/mL、60 pg/mL[16]。他们构建了一种新型的拉曼探针AuNPs-G123,由于它与检测线(Test Zone, TZ)上的大鼠IgG2b结合力远远高于对照线(Control Zone, CZ)上的互补寡核苷酸链,因此当CXCL9存在时,TZ和CZ会同时存在,并且随CXCL9浓度的变化,颜色也会随之发生改变。基于此,本文合成了一种嵌入4-硫基苯甲酸(4-Mercaptobenzoic acid, 4-MBA)的稳定金银合金(AlloyNPs)作为高灵敏的SERS基底,在其表面偶联IFN-γ的特异性适配体以构建SERS基底-适配体偶联物(AlloyNPs-APT)作为为检测探针,同时以磁珠-IFN-γ特异性抗体的复合物为捕获探针,构建了一种针对IFN-γ的抗体-适配体杂交三明治结构的SERS高灵敏检测方法。

2 实验

2.1 试剂与仪器

2.1.1试剂

氯金酸(Chloroauric Acid, 99.9%, HAuCl4•3H2O)、4-硫基苯甲酸(4-Mercaptobenzoic acid, 99%, 4-MBA)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)、硝酸银(Silver nitrate, ≥99%, AgNO3)、L-抗坏血酸(L-Ascorbic Acid, AA)、吐温 20(Tween 20)、碳酸钾(Potassium carbonate, ≥99%, K2CO3)、十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, ≥98.5%, SDS)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, ≥98%, BSA)、人血清(human serum)购于Sigma-Aldrich公司;柠檬酸钠(sodium citrate, 98%, NaC6H5O7)、氯化钠(Sodium chloride, NaCl)购于国药集团化学试剂有限公司;氨水(Ammonia solution, NH4OH)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride, 98%, TCEP)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris(hydroxymethyl)aminomethane, ≥99%, Tris-HCl)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;干扰素-γ适配体(IFN-γ aptamer, 5’-GGG GTT GGT TGT GTT GGG TGT TGT GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T-3’)购于生工生物工程上海股份有限公司;偶联生物素的人源干扰素-γ抗体(Human IFN-γ biotinylated antibody, biotin-IFN-γ antibody)购于安迪生物科技上海有限公司;链霉亲和素修饰的磁珠(BeaverBeadsTMStreptavidin,粒径为300 nm)购于苏州海狸生物医学工程有限公司;重组人IFN-γ蛋白(Recombinant Human IFN-gamma Protein, IFN-γ Protein)购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。试验中所用的去离子水(18.2 MΩ•cm-1)由上海力康SmartPlus纯水系统提供。

2.1.2仪器设备

BWS465-785S拉曼光谱仪(必达泰克光电科技上海有限公司)用于拉曼光谱采集;紫外-可见分光光度计(南京菲勒仪器有限公司)用于测试SERS探针的吸光度;场发射扫描电子显微镜(Gemini-300,日本蔡司)和透射电子显微镜(FEI Talos F200S,美国)用于SERS探针的形貌和结构表征。

2.2 方法

2.2.1SERS基底(AlloyNPs)的制备

2.2.1.1金纳米颗粒(Gold nanoparticles, AuNPs)的合成

本研究采用最为经典和常用的方法即Frens报道的柠檬酸三钠还原氯金酸的方法[17]。具体操作为:2.5 mL 的10 mM 氯金酸溶液加入到97.5 mL 的去离子水中在磁力剧烈搅拌的同时加热到沸腾后,然后快速加入1.5 mL柠檬酸钠溶液(1%)并继续加热30 min,随后停止加热并继续搅拌直至溶液冷却至室温,得到粒径约为30 nm的AuNPs。用0.22 μm Millipore滤膜过滤后将其密封避光置于4 ℃冰箱保存备用。

2.2.1.24-MBA嵌入的金银合金纳米颗粒(Au-MBA-Ag Alloy nanoparticles, AlloyNPs)的合成

在400 μL AuNPs溶液中加入8 μL 1 mM 4-MBA后震荡孵育3 h,经6000 rpm 25 ℃ 10 min离心清洗两次后溶解于400 μL去离子水,并与400 μL的1 wt% PVP溶液轻轻混合。随即依次加入100 μL 1 mM AgNO3溶液、32 μL NH4OH溶液和300 μL 1 mM HAuCl4溶液,混合均匀后立即快速加入400 μL 20 mM L-抗坏血酸(AA)溶液,并在室温下混匀1 h。最后,6000 rpm 10 min 25 ℃离心洗涤溶液两次后重新分散于去离子水中,即得到作为SERS基底的AlloyNPs。

2.2.2SERS基底/适配体偶联物(AlloyNPs-APT)的制备

首先,10 mg/mL TCEP 溶液与100 μM IFN-γ适配体溶液(v∶v=1∶1)在室温下孵育1 h用以激活IFN-γ适配体的双硫键。激活后的适配体转移到100 μL AlloyNPs溶液中300 rpm 25 ℃ 孵育16 h后,加入1% SDS并调整其最终浓度为0.01%后继续孵育1 h。随后,每1 h加入1 μL含有1 M NaCl的10 mM Tris-HCl (pH 8.2) ,共加入5 μL,之后在25 ℃下继续孵育24小时。反应完成后,所得产物在4500 rpm 10 min 25 ℃离心以去除未结合的适配体,并重新溶解于0.01 M PBS 溶液(含0.1% Tween 20 和1% BSA,pH 7.4),得到SERS基底-适配体偶联物(AlloyNPs-APT)以作为检测探针,并储存在4 ℃冰箱备用。

2.2.3IFN-γ的检测

5 μL链霉亲和素修饰的磁珠(magnetic nanobeads, MBs)经0.01 M PBS(pH 7.4)清洗后,分别与不同体积的0.2 mg/mL生物素修饰的IFN-γ抗体在25 ℃、850 rpm下孵育1 h。随后,0.01 M PBS(pH 7.4)清洗去除未结合的IFN-γ 抗体后与100 μL 1% BSA 在25 ℃、850 rpm下孵育30 min以封闭MBs的非特异性吸附结合位点。最后不同浓度(0 pg/mL, 1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 500 pg/mL, 1 ng/mL)的IFN-γ 蛋白在4 ℃下与MBs-IFN-γ抗体孵育过夜,并用0.01 M PBS 溶液(含0.1% Tween 20 和1% BSA,pH 7.4)清洗3次以去除游离的IFN-γ蛋白。最后加入25 μL AlloyNPs-APT偶联物在850 rpm 25 ℃ 孵育2 h,用含有0.1% BSA和0.01% Tween 20的PBS溶液清洗两次后进行SERS检测。

2.2.4仪器参数设置及数据处理

每次试验前,拉曼光谱仪使用硅片(Si)在521 cm-1作为基准峰进行仪器校正,激光波长为785 nm半导体激光光源,激光强度设置为34 mW,积分时间为10 s,光谱扫描的波数范围为200～2000 cm-1。每个样品取8 μL滴在石英比色皿上获取SERS信号,每个样品至少重复测量3次以得到准确的结果。

Labspec5软件对拉曼光谱进行基线校正后,使用Origin 2018软件对数据进行处理和绘图。

3 结果与讨论

3.1 实验原理

本文构建了一种基于适配体和抗体的杂交结构识别和检测IFN-γ蛋白的SERS高灵敏快速检测方法。如图1所示,我们首先将作为SERS报告分子的4-MBA嵌入金银合金纳米颗粒以合成具有高灵敏性的SERS基底(AlloyNPs),之后再与适配体偶联构建作为检测探针的AlloyNPs-APT偶联物。同时基于亲和素和生物素能紧密结合的原理,在链霉亲和素修饰的磁珠表面组装生物素修饰的抗体,以构建能够分离捕获IFN-γ蛋白的捕获探针。当IFN-γ蛋白存在于检测体系时,由于其能够同时被抗体和适配体识别并结合,捕获探针、IFN-γ蛋白、检测探针能够形成稳定的三明治结构,获得较高的拉曼信号;当IFN-γ蛋白不存在时,三明治结构则不能形成,检测探针游离于上清液中,仅获得较低的拉曼信号。

图1 干扰素-γ检测的实验流程图 A,适配体-SERS探针的制备;B,磁珠与抗体偶联;C,实验流程Fig.1 Schematic of the workflow of the assay for IFN-γ detection A, the synthesis of aptamer conjugated AlloyNPs; B, the binding between the antibody and magnetic bead; C, experimental procedure

3.2 参数优化

3.2.14-MBA体积的优化

研究表明4-MBA嵌入合金的浓度会影响SERS基底的信号强度[18],因此我们对4-MBA的体积进行了优化。我们在1 mL AuNPs溶液中分别加入不同体积(10 μL,20 μL,50 μL)的4-MBA溶液,合成AlloyNPs。通过图2D和E紫外可见光吸光光光谱,我们可以看出当4-MBA的体积为20 μL时,AuNPs-MBA和AlloyNPs的吸光度最高,说明在此4-MBA浓度下,其最为稳定。如图2A和B所示,当4-MBA体积为20 μL时,AlloyNPs基底的拉曼强度最高,强度为6524,是10 μL的3.89倍,是50 μL的5.30倍;当4-MBA的体积相同时,AlloyNPs基底的拉曼强度是常用的AuNPs-MBA基底拉曼强度的4.03倍。

图2 AlloyNPs合成4-MBA体积优化结果图 A,不同体积(10 μL,20 μL,50 μL)1 mM MBA修饰的AlloyNPs拉曼光谱;B,拉曼位移为1080 cm-1时相应拉曼强度的柱状图和归一化线;C,AlloyNPs和AuNPs-MBA的拉曼光谱比较;D,不同体积(10 μL,20 μL,50 μL)1 mM MBA修饰的AuNPs-MBA紫外可见光吸光光光谱;E不同体积(10 μL,20 μL,50 μL)1 mM MBA修饰的AlloyNPs紫外可见光吸光光光谱Fig.2 Volume optimization diagram of MBA A, Raman Spectra of AlloyNPs Tag modified with 1 mM MBA of different volumes (10 μL, 20 μL, 50 μL); B, Columnar distribution and normalized lines of the corresponding SERS intensity at 1080 cm-1; C,Raman spectra of AlloyNPs Tag and AuNPs-MBA with 20 μL MBA; D, UV-Visible absorption spectra of AuNPs-MBA modified with 1 mM MBA of different volumes (10 μL, 20 μL, 50 μL); E, UV-Visible absorption spectra of AlloyNPs modified with 1 mM MBA of different volumes (10 μL, 20 μL, 50 μL)

3.2.2适配体浓度的优化

覆盖在SERS基底上的适配体浓度对其SERS信号的强度及SERS基底的稳定性非常重要[19],因此我们对与AlloyNPs结合的IFN-γ适配体浓度进行了优化。我们将激活后的不同体积(2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL)的适配体经与100 μL AlloyNPs溶液孵育后,对其拉曼信号进行测试。如图3A和B所示,我们发现当适配体浓度为4 μM时,AlloyNPs-APT的拉曼强度最高。因此在后续实验中,我们采用适配体的浓度为4 μM。

图3 适配体浓度优化结果图 A,不同浓度(1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM, 8 μM)适配体修饰后AlloyNPs-APT的拉曼光谱;B,拉曼位移为1083 cm-1时相应拉曼强度的柱状分布和归一化线Fig.3 Concentration optimization diagram of aptamer A, Raman Spectra of AlloyNPs-APT modified with aptamer of different concentration (1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM, 8 μM); B, Columnar distribution and normalized lines of the corresponding SERS intensity at 1083 cm-1

图4 抗体体积优化结果图(0.5 μL,1.5 μL,2.5 μL,5 μL) A,不同体积(0.5 μL,1.5 μL,2.5 μL,5 μL)IFN-γ抗体修饰后样品的拉曼光谱;B,拉曼位移为1083 cm-1时相应拉曼强度的柱状分布和归一化线Fig.4 Volume optimization diagram of antibody (0.5 μL,1.5 μL,2.5 μL,5 μL) A, Raman Spectra of sample modified with IFN-γ antibody of different volumes (0.5 μL,1.5 μL,2.5 μL,5 μL); B, Columnar distribution and normalized lines of the corresponding SERS intensity at 1083 cm-1

3.2.3抗体体积的优化

当抗体到达一定浓度时,与磁珠的结合力会达到饱和,即当抗体浓度再增加时,磁珠表面结合的抗体量不再增加,于是我们对于抗体的体积进行了优化。我们将清洗后的磁珠分别与不同体积(0.5 μL,1.5 μL,2.5 μL,5 μL)的0.2 mg/mL抗体混匀孵育1 h后,与优化后的AlloyNPs-APT混合2 h后,对其进行拉曼测试。如4A和B所示,当抗体体积为2.5 μL时,样品的拉曼强度最高。因此在后续实验中,我们采用抗体的体积为2.5 μL。

3.3 测试

3.3.1在PBS中的测试结果

为测试该方法用于检测IFN-γ的可行性,我们将含有不同浓度的IFN-γ PBS溶液(0 pg/mL, 1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL)在4 ℃下与MBs-IFN-γ抗体过夜孵育后再与AlloyNPs-APT偶联物孵育并测得拉曼强度,并且每个浓度各重复3次。通过图5A和B可以看出,随着IFN-γ浓度的不断增加,拉曼强度也随之增强,尤以1080 cm-1处的最明显。在拉曼位移为1080 cm-1处,以IFN-γ浓度的对数为横坐标,拉曼强度为纵坐标,可获得不同IFN-γ浓度和SERS信号强度之间的线性关系。如图5C所示,其线性回归方程为y=4699.12x+2525.68,R2=0.9769,检测限计算为0.26 pg/mL。此外,通过图5D可以看出,该检测方法在PBS环境中对IFN-γ的检测结果重复性较好,相对标准偏差(RSD)均在10%以下。

图5 PBS溶液中的检测结果 A,PBS环境中不同浓度(0 pg/mL, 1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL)IFN-γ的SERS光谱;B,拉曼位移为1080 cm-1时相应拉曼强度的柱状分布和归一化线;C,IFN-γ浓度及拉曼强度建立的标准曲线;D,重复性实验Fig.5 Test results in PBS A, SERS spectra of IFN-γ at different concentrations (0 pg/mL, 1 pg/mL, 5 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL) in PBS; B, Columnar distribution and normalized lines of the corresponding SERS intensity at 1080 cm-1, C, The calibration curve based on IFN-γ concentration vs Raman intensity; D, Repetitive experiments

3.3.2在血清中的测试结果

为验证该方法在临床应用中的可行性,我们将血清用0.01 M PBS(pH 7.4)稀释10倍,并在10倍稀释的血清中添加IFN-γ,并利用PBS建立的标准曲线定量检测IFN-γ。通过表1可以看出,在血清中的回收率为98.7%～108%,说明该方法有希望应用在实际的临床检测中。

表1 血清中的回收率检测结果Table 1 Recovery rate test results in serum

4 结论

本文基于抗体和适配体的杂交结构,开发了一种SERS抗体/适配体传感器用于干扰素-γ的快速检测。研究结果表明,该方法对IFN-γ的检测具有高灵敏度,其在PBS中的检测限为0.25 pg/mL,在血清中的回收率为98.7%～108%。在研究中我们也发现在实际样本中适配体-抗体的杂交结构具有非特异性吸附会造成结果的假阳性,因此解决非特异性吸附对实际血清样本中干扰素-γ快速、准确的检测至关重要。