APP、PIP在儿童支气管哮喘中的作用

李 明 刘华清 毕雅茹

支气管哮喘是常发生在儿童身上的慢性呼吸道系统疾病，并且随着目前空气不断恶化，发病率呈现逐年上升的趋势[1]。由于支气管哮喘发病原因复杂，影响因素较多，所以导致儿童支气管哮喘的控制效果并不理想，治疗效果反复，给患儿生活及学业带来了诸多不便，严重影响了患儿家庭，给患者家庭及社会带来了极大的负担。哮喘临床表现为气道炎症、气道高反应性和吸入性抗原引起的可变气流阻塞[2]。目前认为哮喘的发病机制与免疫、神经、精神、内分泌因素、遗传学背景和神经信号通路密切相关。在哮喘中，一些由组织细胞产生的特定蛋白质可能被分泌到血液循环中。因此，蛋白质组学可能是一种有用的方法来检测和定量这些血清蛋白，并确定他们是否在哮喘中有差异表达，并可能成为潜在的治疗靶点[3]。

APP（淀粉样前体蛋白）属于I型跨膜糖蛋白，分子量在110～130 KD，分布于人体的心、脑、肺、肾等组织器官中；其构成包含一个大型的N端膜外（氨基端）结构域和较小的C 端胞尾区（胞内羧基端）；APP蛋白从N端到C端共分成三个区域（E1、E2、E3），这三个区域都是高度保守的区域；其中，E1 和E2 两个区域为胞外结构部分，E3 区域为胞内结构部分；APP经β、γ分泌酶依次剪切后产生可溶性 APPβ（sAPPβ）和CTF99，以及导致阿尔兹海默症发病主要原因的β淀粉样肽（Aβ）[4]；APP的糖化可以影响其在细胞内的转运定位和成熟加工[5]。PIP（催乳素诱导蛋白）基因位于7 号染色体长臂3 区4 带（7q34），编码含146 个氨基酸残基组成的前体蛋白，成熟产物为17KD的单链糖蛋白。本文选择APP、PIP两个蛋白组学进行分析，研究二者血清蛋白组学与儿童支气管哮喘之间的关系，报告如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2021年10月-2022年10月本医院东区儿科收治的40 例哮喘患儿作为观察组。①纳入标准：年龄3～14 岁；确诊依据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》（2016年版）；均未诊断为免疫性疾病、慢性和其他影响血清蛋白的疾病；入组前3 个月内未服用相关益生菌制剂；且1 周内均未接受过激素治疗。②排除标准：排除合并过敏性鼻炎、急性呼吸道感染、肺部疾病、异物以及其他慢性疾病者；未参与其他的临床研究。严格按照纳入及排除标准，对纳入患儿及其家属进行哮喘护理指导及健康培训，告知其相关注意事项及研究过程中可能存在的风险，签署知情同意书；观察组共纳入40 例患者进行随机编号，其中男性20 例，女性20 例，年龄3～14 岁。对照组：选择同期体检正常的40 例儿童作为对照组，对儿童进行随机编号，其中男20 例，女20 例，年龄3～14 岁。两组儿童在性别构成、年龄分布等一般资料方面组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经本院伦理委员会审核同意，研究对象入选后由其家属代替签署知情同意书。

1.2 标本采集及指标检测 ①标本采集：患儿入院后第2 天上午，抽取静脉血4 mL，置于室温22 ℃～25 ℃黑暗1 h、上清液用移液管转移至新管中，置于-80 ℃保存，采用ProteoExtract白蛋白/IgG去除试剂盒（Merck Co）提取血清样本，各血清样品总蛋白提取量均在400 μg以上，蛋白条带清晰、完整、均匀。将蛋白溶液加入Bradford蛋白分析工作溶液。②指标检测：检测总蛋白量后，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯蓝染色评价样品质量。使用iTRAQ技术标记酶解后的肽段，蛋白定量后，将60 μg蛋白溶液置于离心管中，加入5 μL二硫苏糖醇溶液，37 ℃静置1 h，加入碘乙酰胺溶液20 μL，室温避光1 h，离心，弃上清。用100 μL尿酸缓冲液（8 M尿素，100 mM Tris-HCl；pH值8.0）。用NH4HCO3（50 mM，100 μL）洗涤样品三次，在超滤管中加入胰蛋白酶（蛋白与酶的比例为50：1）。样品在37 ℃下酶解12～16 h。最后，用C18 标记并脱盐利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测关键蛋白葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）；显微镜直接计数嗜酸性粒细胞。

1.3 数据指标收集 ①肺功能测量工具：德国耶格小儿肺功能仪。测量指标：第一秒用力呼气量（FEV1）、第一秒用力呼气量/用力肺活量（FEV1/FVC）、用力呼气中期流量（FEF）25%～75%、FEF 50%、FEF 75%；FEV1%是第一秒用力肺活量（FEV1）/用力肺活量（FEV）的比值。当FEV1%＜70%时即为降低，70%-60%-40%分别为轻、中、重度降低。正常状态，FEV1%大于80%，低于80%表明气道阻塞性通气障碍的存在，如哮喘。PEF是指测量用力肺活量时，呼气流量最快时的瞬间流速，主要反映呼吸肌的力量及气道是否被阻塞。MMEF%是用力呼气曲线中间一半的平均用力呼气流量的测量值与预测值之比，正常为＞70%，主要对反映小气道病变，具有较高的准确性及敏感性。测量频次：每项指标测定3 次，计算平均值。注意事项：测量前详细告知儿童及家长相关注意事宜，测量前行容量校准，4 岁以上1～3 L定量筒，3 岁以下为0.1 L定量筒。②嗜酸性粒细胞百分比：嗜酸性粒细胞百分比主要反映过敏性疾病中气道炎症发生、发展和黏膜损伤修复等方面具有重要的临床意义，其数值越高，提示气道高反应越明显（正常值为0.4%～4%）。

1.4 APP、PIP相关蛋白表达 使用LC-MS/MS光谱系统鉴定了两组之间的差异表达蛋白（DEPs）。标记样品在40 μL 0.1%甲酸水溶液中重新溶解后，采用LC -MS/MS进行分析。流动相为A相（2%乙腈/0.1%甲酸/98%水）和B相（80%乙腈/0.08%甲酸/20%水）。柱与95%液相A液相平衡。从B开始的梯度调整如下：0～80 min，从0%线性增加到40%；80～80.1 min，增至95%；80.1～85 min，维持在95%；85～88 min，降至6%。分离样品使用Q萃取HF-X质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行分析。使用Proteome Discover软件，版本2.2.0.388，以FASTA格式搜索Uniport Human数据库。

1.5 统计学方法 采用SigmaPlot软件进行双尾Mann-Whitney检验。分类变量（仅性别数据）比较采用Fisher精确检验卡方检验。计量资料使用（±s）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。蛋白质折叠变化（FC）≥1.5，P＜0.05 为差异有统计学意义。FC＞1.5 表示蛋白上调，FC＜0.667 表示蛋白下调；FC在0.667～1.5 表明两组之间的蛋白表达没有明显变化。

2 结 果

2.1 两组患儿肺功能指标比较 观察组患儿的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%等肺功能指标及含量均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组患儿肺功能指标检测结果比较（±s）

表1 两组患儿肺功能指标检测结果比较（±s）

组别nFEV1(L)FEV1/FVCFEF 25%～75%FEF 75%FEF 50%对照组4090.43±6.3779.17±13.2574.53±13.2771.46±13.4273.64±13.46观察组4086.15±5.2560.37±11.4652.57±14.3741.38±14.2517.32±10.37 t 3.3036.8357.1419.77512.09 P 0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 两组患儿G-6-PD和嗜酸性粒细胞各组检测结果比较 观察组患儿G-6-PD均低于对照组，而嗜酸性粒细胞数均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。组别n 嗜酸性粒细胞(106/L) G-6-PD(u/g Hb)

表2 两组患儿嗜酸性粒细胞数及G-6-PD数据比较

2.3 APP、PIP的相关性分析 APP、PIP的表达与观察组患儿的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%及G-6-PD呈负相关（P＜0.05），与嗜酸性细胞数呈正相关，故二者在有或没有哮喘的儿童血清中蛋白表达水平有显著差异，见表3。

表3 APP、PIP的相关性分析

3 讨 论

支气管哮喘是由多种原因相互作用引起的慢性气道炎症。呼吸道慢性炎症初始可引起呼吸道功能改变，由于炎性的慢性刺激可引起呼吸道结构性改变为气道重塑[6]。哮喘的炎性涉及多种活化细胞，这些细胞释放促炎症细胞因子介质升高，炎症效应引起不可逆的气道结构及功能上改变，其结构性特征是气道壁增厚、平滑肌细胞增生肥大等，引起气道高反应性及气道阻塞，从而出现呼吸困难、喘息、胸闷等症状[7]。而新的哮喘管理范式，即通过使用“生物标志物”对哮喘患者进行分类，并开出靶向治疗处方，将取代“一刀切”的哮喘管理方法[8]。

在哮喘发病过程中，炎性细胞在气道组织中的浸润、聚集、激活和释放是其主要特征，在气道重塑的过程中这些细胞因子发挥重要作用[9]，在本研究中，观察组患儿APP、PIP的表达与其FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%及G-6-PD呈负相关（P＜0.05），与嗜酸性细胞数呈正相关。APP是一种广泛表达的跨膜蛋白，在神经元功能中起到不可或缺的作用，现已被证明可以促进突触形成、树突状发芽和神经元迁移等作用，而在最新研究表明该蛋白参与了哮喘表达的上调，另外还通过了以下途径：神经元生长、粘附、轴突生成、细胞迁移、蛋白运动调节、细胞凋亡、与细胞外基质成分结合。有些研究还表明APP参与了肿瘤细胞的过度生长，如乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、肺癌等多种癌症中具有显著的功能[10]。APP通过β-分泌酶和γ-分泌酶参与的淀粉样蛋白途径水解后的主要产物，Aβ40 及Aβ42 是一种致病性淀粉样蛋白，是阿尔茨海默病老年斑的主要成分[11]。致病性淀粉样蛋白在脑组织中的沉积是导致阿尔茨海默病的病理基础。PIP是一种小的分泌糖蛋白，为单条多肽链。在唾液腺、汗腺和泪腺等腺体中表达，存在于体液中。PIP在乳腺肿瘤患者的预后中具有重要价值，PIP高表达的乳腺肿瘤患者五年生存率及十年生存率更高。PIP在干眼病中表达过强，与干眼病的严重程度相关[12]。该蛋白亦具有免疫调节功能，并在细胞介导的过继免疫中发挥重要作用，PIP与来自几个属的细菌结合，表明该蛋白可能也参与先天免疫和保护宿主免受微生物感染[13]，该蛋白也参与了哮喘表达的上调，对自然免疫细胞有调节作用。PIP可以特异性降解纤维连接蛋白，帮助宿主抵抗感染，并在癌细胞的迁移、粘附和侵袭中发挥作用。

综上所述，本研究显示淀粉样前体蛋白和泌乳素诱导蛋白在儿童哮喘中表达上调，与临床相关指标及参数密切相关，表明了APP、PIP与哮喘患儿的疾病特异性密切相关。这些研究结果均提示APP、PIP可能成为儿童哮喘潜在的检测标志物和新的治疗靶点，但需进一步阐述APP、PIP在儿童哮喘产生发展的确切分子机制。