石蒜年生长周期内NSC及其代谢酶活性变化

魏绪英,张 瑶,马美霞,姜雪茹,陈慧婷,吴 靖,杨 玉,蔡军火*

(1.江西财经大学艺术学院,江西 南昌 330032;2.江西农业大学园林与艺术学院,江西 南昌 330045)

石蒜(Lycorisspp.)为石蒜科石蒜属植物,又名红花石蒜,于秋季花后萌叶,且花叶不同时,又被称为“魔术花”。其夏眠习性[1]与原产地(华东地区)的夏季湿润气候不相协调[2],科学研究价值特殊。因花期至今难以有效调控,在世界切花产业中的份额不大[3]。目前,对该属植物的生长发育研究多聚焦于环境因子影响、花芽分化、开花生理、花期调控等方面[4],但较少从非结构性碳水化合物(NSC)含量变化及代谢的视角开展研究。

NSC作为主要的能量储存形式,参与了植物众多的重要生命代谢过程。植物的生理休眠和解除与碳水化合物的积累、转化、代谢关系甚密[5-6]。NSC主要包括淀粉和可溶性糖(如蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、棉籽糖等)[7-10],是植物生长代谢的重要能量供应物质[11],能够反映植物的碳代谢状况及抗逆性[12]。石蒜属植物鳞茎中淀粉含量约占40%[13]。淀粉作为存贮物质,主要供应将来的生长发育需求[14],其合成伴随着生长过程[15]。可溶性糖是植物主要的光合产物、糖的代谢与运转形式[16-17],在渗透调节中起关键作用[18-19]。同时又作为信号分子影响植物的生长发育以及胁迫响应[20]。蔗糖是可溶性糖的主要运输形式和淀粉合成底物[21-22]。光合作用产生的蔗糖,通过韧皮部转运至“库”组织后被水解产生果糖和葡萄糖。因而,植物体内的果糖和蔗糖含量对环境温度的变化较为敏感[23]。

不同物种间的糖积累机制及其代谢酶调控作用差异较大。目前,国内外对球根花卉的糖代谢研究主要集中在百合属植物及与糖积累密切相关的转化酶(InV)、蔗糖磷酸合酶(SPS)和蔗糖合成酶(SuS)上[24-25]。可溶性淀粉合成酶(SSS)和结合态淀粉合成酶(GBSS)的活性是影响鳞茎养分积累的主要因子[26],冷藏可明显增强鳞茎内α-淀粉酶(α-AL)、β-淀粉酶(β-AL)的活性[6],促使葡萄糖含量增加,蔗糖含量降低[27]。SPS一般与蔗糖磷酸酯酶以复合体形式存在,是蔗糖生物合成中的关键限速酶[28]。SuS主要是催化蔗糖分解生成果糖和UDPG(葡萄糖供体),因InV作用生成果糖和葡萄糖[29],能调控糖的积累和流向[29]。果糖经转运进入细胞质后,先被果糖激酶(FRK)或己糖激酶(HXK)磷酸化才能进入到各种代谢途径[30]。FRK对果糖的亲和力远高于HXK[31],是果糖代谢的控制阀[32]和植物源-库代谢的关键激酶,在生长发育调控和逆境胁迫响应中发挥重要作用[31]。

石蒜属(Lgcoris)植物具有独特的生物学特性(花叶不相遇、根叶生长不同步)和夏眠习性[27],生长节律与气候温度密切相关[33]。因对其休眠生理及调控机制缺乏深入研究,至今难以实现切花的周年生产。因此,笔者在前期物候观测的基础上,重点关注了红花石蒜年生长发育过程中,鳞茎内NSC的积累及相关代谢酶的活性变化,旨在从NSC视角探析其独特生长节律的内在生理机制。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试红花石蒜(L.radiata)种球[球径(D)为(3.5±0.2 cm)]于2016年11月定植于江西农业大学试验基地(28.76°E,115.83°N)。在2019—2020年的1个完整年生长周期内,分别在6个不同的生长期(Lo.展叶期;RLe.叶旺长期;LMa.叶成熟期;LWi.叶枯黄期;Dor.休眠期;Flo.开花期。见图1),随机挖掘相同径级的地下鳞茎45粒(分3次重复,每次重复15粒),经去除叶片、根系,并洗净后置于冰盒中作为样品待测。在低温条件下,分别取鳞茎的内层(1～4片)、中层(5～8片)、外层鳞片(9～12片),切碎混匀后用锡箔纸包裹好放入液氮中速冻20 min,再移至-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

Dor. 休眠期 dormancy period; Flo. 开花期 flowering period; Lo. 展叶期 leafing-out period; RLe. 叶旺长期 rapid leaf extension period; LMa. 叶成熟期 leaf maturity period; LWi. 叶枯黄期 leaf withering period。下同。The same below.图1 红花石蒜不同生长发育时期Fig. 1 Different growth periods of Lycoris radiata

1.2 测定方法

1.2.1 营养物质测定

称取新鲜鳞茎组织0.2 g,加入1 mL提取液(苏州科铭有限公司酶测试试剂盒,下同),进行冰浴匀浆经碾磨粉碎待用。可溶性糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖含量分别采用蒽酮比色法测定620、480、480、505、505 nm波长下的吸光值,再根据葡萄糖的标准曲线分别计算出含量。其中,淀粉用高氯酸法提取,均借鉴Buysse等[34]的测定方法。非结构性碳水化合物含量即为可溶性糖和淀粉的含量之和[35-36]。

1.2.2 酶活性测定

称取新鲜鳞茎组织100 mg,加入1 mL提取液,进行冰浴匀浆。在4 ℃条件下10 000转/min离心10 min,取上清液,置冰上待测。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)、结合态淀粉合成酶(GBSS)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、蔗糖合成酶(SuS)、蔗糖磷酸合酶(SPS)、α-淀粉酶(α-AL),β-淀粉酶(β-AL)、淀粉脱分支酶(DBE)、淀粉分支酶(SBE)的酶活性使用紫外分光光度计(型号UV-5200,上海元析仪器有限公司)和酶标仪(Synergy H1,BioTek intruments,美国)法检测。粗酶液与基质液作用,其产物分别在340、340、340、480、480、540、540、540、660 nm处有最大吸收峰。将分光光度计或酶标仪预热30 min以上,调节波长,蒸馏水调零,通过测定吸光度,计算酶的活性(按以每g组织每分钟催化产生1 mg或1 nmol还原糖定义为1个酶活力单位)。

1.2.3 数据处理

采用 SPSS 24.0进行单因素方差分析(邓肯氏法)。

2 结果与分析

2.1 不同生长期鳞茎内NSC变化规律

红花石蒜鳞茎内的8种糖分(NSC总量、淀粉、可溶性糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、还原糖)的含量在不同生长期间的差异均显著(P<0.05)。其中,在年生长周期中,鳞茎内的NSC总含量(淀粉和可溶性糖)、淀粉、蔗糖和葡萄糖含量的变化基本一致,总体呈“先升后降”趋势(图2a、2b、2c)。

不同小写字母表示非结构性碳水化合物含量在不同时期0.01水平上的差异显著。Different lowercase letters indicate significant difference in non-structure carbohydrate at 0.01 level in different periods.图2 红花石蒜非结构性碳水化合物动态变化Fig. 2 Dynamic content changes of non-structural carbohydrates in Lycoris radiata bulb

从图2还可得知,鳞茎内的NSC总含量、可溶性糖、葡萄糖、果糖、还原糖均以叶成熟期(LMa)最高,而淀粉和蔗糖的含量则以叶黄枯期(LWi)最高;而麦芽糖、果糖、葡萄糖、还原糖却均以叶黄枯期(LWi)最低。另外,鳞茎内的可溶性糖、果糖、还原糖、麦芽糖的含量变化也基本一致,总体呈“先升后降再升”趋势。其中,可溶性糖、果糖、还原糖的含量均在叶成熟期(LMa)最高,麦芽糖则以叶旺长期最高,且均在叶黄枯期(LWi)降低后又迅速上升(图2b、2c、2d)。由此可见,淀粉积累的峰值要滞后于可溶性糖。另外,还原性糖在可溶性糖中的占比也以展叶期最高(76.2%),而以叶黄枯期最低(37.1%)。这说明,NSC的含量变化与叶片的生长状态密切相关。

此外,不同时期鳞茎内的果糖含量均显著高于蔗糖(图2b、2c),且果糖在可溶性糖中的占比较大。这说明,果糖在红花石蒜的年生长节律变化中也扮演着重要角色。

在休眠期,红花石蒜鳞茎内的NSC含在Dor期保持较高水平,也有侧面说明了其“夏眠”仅是地上部的休眠,而地下部鳞茎的内部生理仍然“活跃”。

2.2 不同生长期鳞茎内淀粉代谢酶变化规律

红花石蒜年生长过程中NSC代谢酶活性动态变化情况表明(图3),不同发育阶段红花石蒜鳞茎内的9种NSC代谢相关酶活性均差异显著(P<0.01)。其中,NSC代谢酶总活性以叶枯黄期最高[1 473.82 μg/(min·g)],而以开花期最低[1 187.29 μg/(min·g)],均显著高于或低于其他5个时期。在同一时期,AGP酶的活性最高均显著高于其他8种酶。

在红花石蒜的年生长周期中,AGP、SPS活性变化均呈“先升后降”趋势,而SSS、SuS、DBE 3种酶的活性变化则呈完全相反的趋势。其中,SPS活性的峰值出现(叶成熟期)的早于AGP(叶枯黄期);而SSS、SuS的谷值出现时期(叶成熟期)也早于DBE(休眠期)。另外,GBSS与SBE的活性变化也基本呈相反趋势,且除LWi期外,SSS活性总体显著高于GBSS。这说明,在石蒜生长过程中鳞茎中的淀粉代谢是以支链淀粉为主。

从展叶期(Lo)至开花期(Flo),β-AL活性和α-AL的变化趋势基本相似(峰值在Flo期,谷值在LWi期),且除LWi期外,β-AL的活性始终高于α-AL(图3a)。结合图2c、2d可以发现,麦芽糖的含量始终高于葡萄糖,但麦芽糖的谷值时期(LWi)正好与葡萄糖的谷值时期重叠。这说明,β-淀粉酶水解淀粉的主要产物是麦芽糖,不是葡萄糖。

除LMa阶段外,SuS的活性也始终显著高于SPS(图3d、图3c),这与不同时期鳞茎内的果糖含量显著高于蔗糖相呼应(图2b、2c)。

SBE是参与植物支链淀粉合成的关键酶。本研究表明,AGP和SBE的酶活性变化趋势大体相反(图3b、3d)。另外,SBE活性也始终高于DBE,且二者均在Flo期较高,但前者峰值出现在RLe期,后者的峰值则出现在Lo期(图3d)。这说明,石蒜鳞茎内淀粉的合成是以支链淀粉占优势。

2.3 鳞茎内NSC、代谢酶相关性分析

由红花石蒜NSC含量及代谢酶活性相关性分析结果见表1。

表1 红花石蒜NSC含量及代谢酶活性相关性分析

由表1可知,石蒜鳞茎内的淀粉含量与AGP、SPS的活性变化呈极显著与显著正相关,而与SSS、SBE、DBE的活性变化呈显著负相关。另外,淀粉与蔗糖的含量变化也呈极显著的正相关,而与麦芽糖的含量变化呈显著负相关(R=-0.58,P<0.05)。说明AGP、SPS均参与了淀粉的合成过程,其中SPS主要通过促进蔗糖的合成而实现;而SSS、SBS、DBE主要参与淀粉的水解过程,且在一定程度上淀粉的合成速度取决于蔗糖含量的水平。

另外,麦芽糖的含量变化与果糖(R=0.84,P<0.001)、葡萄糖(R=0.49,P<0.05)含量呈极显著与显著正相关;果糖与葡萄糖的含量变化也呈极显著正相关(R=0.77,P<0.001)。这说明,鳞茎内的二糖与单糖的含量变化密切相关。从表1还可得知,蔗糖与果糖、麦芽糖的含量变化及SBE、β-AL的活性均呈极显著负相关,而与GBSS(R=0.80,P<0.001)的活性变化呈极显著正相关。然而,GBSS又与果糖、葡萄糖、麦芽糖的含量变化也均呈极显著负相关。这说明,红花石蒜鳞茎内结合态淀粉的合成主要取决于蔗糖的供给水平,而其水解的强度则会显著影响体内的果糖、麦芽糖的水平。

表1还表明,果糖与麦芽糖的含量变化呈极显著正相关(R=0.84,P<0.001),与DBE的活性变化呈显著正相关(R=0.48,P<0.05),而与GBSS(R=-0.87,P<0.001)、SuS活性均呈极显著的负相关(R=-0.84,P<0.001)。

3 讨 论

3.1 石蒜的年生长节律与鳞茎NSC含量及相关代谢酶的活性变化密切相关

鳞茎内NSC含量及其代谢酶活性易受外界条件、自身的生长与代谢状况影响。石蒜的鳞茎富含淀粉和胶质[37],是养分、非结构性碳和水分的存贮库[27]。

本研究发现,在Dor—Flo—Lo时期,鳞茎中的蔗糖、淀粉含量均出现了显著下降,说明该过程存在大量的淀粉水解和蔗糖消耗,转化为葡萄糖和麦芽糖。这与百合类植物在解除休眠至出苗过程中[38-39]和开花过程中[40]的淀粉含量变化类似。在Lo—RLe时期,随着叶片的生长及其光合作用能力的增强,鳞叶中NSC各组分的含量均出现了上升,鳞茎的功能开始由“源”向“库”转变。这与罗琦[41]的研究结果一致。

在RLe—LMa—LWi期,叶片通过光合作用形成的碳水化合物能够逆浓度梯度的向下运输至鳞茎[42]。其中,RLe—LMa期间鳞叶中的NSC总量呈上升趋势,而在LMa—LWi期间又下降,淀粉及蔗糖的总量却一直呈上升趋势;而在LWi—Dor期,鳞叶中的淀粉、蔗糖含量均出现显著下降。该结果与孙红梅等[25]、吴沙沙[43]对百合的研究结果基本一致,这可能还与石蒜的能量回收率较高有关。此外,不同时期鳞茎内的果糖含量均显著高于蔗糖,且与麦芽糖含量呈极显著正相关,推断其生理作用与石蒜的独特生物学特性有关。

综上所述,不同的NSC组分在红花石蒜的年生长周期中出现的峰值时期不同,总体表现于淀粉的积累峰值要滞后于可溶性糖。其中,淀粉和蔗糖的含量均以叶黄枯期(LWi)最高,可溶性糖、果糖、还原糖、葡萄糖的含量均在叶成熟期(LMa)达到最高,而麦芽糖的含量则以叶旺长期(RLe)最高。这表明,NSC含量的变化与红花石蒜叶片生长的旺盛状态密切相关,可以根据叶片的生长情况大体判别其“源-库”转化状态。在Dor—Flo—Lo,鳞茎以发挥着“源”的作用为主(淀粉水解为葡萄糖),而在RLe—Lwi期,鳞茎主要发挥“库”功能。可见,伴随鳞茎内淀粉和蔗糖含量的升高,叶片渐趋于老化和进入休眠。这也从能量消耗的角度说明了石蒜地上部“叶片休眠”,地下部却未真正休眠。

3.2 NSC的含量变化受相关代谢酶的调控

本研究还表明,在石蒜年生长周期中,淀粉的含量变化不仅与蔗糖的含量显著正相关,还与AGP、SPS的活性变化也呈显著正相关,而与麦芽糖的含量、SSS、SBE、DBE的活性变化呈显著负相关。蔗糖含量与淀粉的含量、GBSS活性呈极显著正相关,而与β-AL、SBE活性呈极显著负相关,且SPS与SuS呈极显著负相关。这说明,鳞片内的淀粉积累主要受AGP、SPS(正向)和SSS、SBE、DBE(反向)的共同调控;鳞茎中的蔗糖水平主要受SPS和SuS的双向合成调控,还要受淀粉水解(α-AL、β-AL、SBE)的综合影响。

果糖(单糖)与麦芽糖(二糖)含量呈极显著正相关,且二者均与DBE显著正相关,而与GBSS、SuS呈极显著负相关极显著负相关。说明鳞片内的果糖积累量主要受DBE(正向)和GBSS、SuS(反向)共4种酶的双向调控作用。

此外,GBSS与SuS的活性变化呈极显著正相关,而与β-AL、果糖、葡萄糖、麦芽糖呈极显著负相关,与淀粉的含量变化相关性却不显著。这说明,GBSS虽也参与了鳞茎内淀粉的正向调控作用,但不起主导作用。推测GBSS主要通过与SuS、β-AL配合,调节还原糖含量而起作用。

在年生长周期中,不同阶段的鳞茎内9种糖代谢酶的活性均有极显著差异(P<0.01);在同一时期,AGP酶的活性显著高于其他8种酶,除LWi期外,β-AL的活性始终高于α-AL,SBE活性始终高于DBE,SSS和SuS的活性也总体分别高于GBSS、SPS。这与不同时期鳞茎内的果糖含量均显著高于蔗糖相呼应,从侧面证实了“石蒜鳞茎中的淀粉是以支链淀粉为主”的结论[13]。

3.3 果糖在红花石蒜的生长节律中发挥着重要作用

FRK是果糖代谢的控制阀和植物源-库代谢的关键激酶[32],果糖进入各种代谢途径前,须先被FRK或HXK磷酸化[30],在生长发育调控和逆境胁迫响应中发挥重要作用[30]。果糖还可作为信号分子直接或通过与其他信号通路交叉调节基因的表达[44]。前期的研究表明,在休眠期的石蒜鳞茎盘中的果糖含量显著高于鳞片[45],说明果糖也是鳞茎内NSC转运的主要形式之一。本研究也发现,在年生长周期内,石蒜鳞叶的果糖含量始终显著高于其他3种可溶性糖(蔗糖、葡萄糖、麦芽糖),且与麦芽糖含量、DBE显著正相关,而与GBSS、SuS、蔗糖含量显著负相关。由此推测,鳞茎内高含量果糖的来源不限于由光合器官转运至鳞茎内的蔗糖水解,主要来源很可能是淀粉水解而产生的蔗糖。

InV和SuS对于调节“源”与“库”关系和促进叶片制造光合产物均具有重要意义[46]。SuS活性通常与淀粉的积累或者器官的生长发育紧密相关[47]。当InV活性较高时,蔗糖积累大量减少[48]。本研究发现,果糖、葡萄糖的含量与SuS酶活性呈显著负相关,这与果糖和葡萄糖抑制SuS的降解活性的结论基本吻合[49]。很显然,InV在石蒜NSC代谢中也发挥着一定的作用。然而,不同形式的InV在植物不同发育阶段和不同组织中的作用不同[50-52]。笔者仅重点关注了不同发育期的6种NSC组分及9种相关代谢酶的活性变化,尚未对InV、FRK、HXK等酶在鳞茎生理代谢中的作用进行研究,有待下一步深入探究。