巨型艾美耳球虫Th1类细胞因子刺激性分子EmARM-β对鸡PBMC和T细胞亚群免疫功能的影响

蒲响林,潘仰栋,相权珈,孙晓婷,陆明敏,严若峰,徐立新,李祥瑞,宋小凯

(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

鸡球虫病是由艾美耳球虫感染引起的一种肠道疾病[1]。鸡球虫侵袭宿主肠道的不同部位[2],破坏肠上皮细胞,导致饲料转化率降低、体重下降、血便等症状,甚至导致宿主死亡,同时还会抑制宿主免疫系统,引起继发感染,给养禽业带来了巨大经济损失[3-6]。目前,鸡球虫病主要以药物防治为主[7],但耐药性、药物残留、防治费用高等问题限制了药物的使用[8-10]。虽然传统球虫活疫苗如CocciVac和Immucox等在世界范围内已经投入使用[4,11],但其价格昂贵,难以推广,且具有导致球虫病暴发的风险[12-13]。因此,开发安全有效的鸡球虫病新型疫苗迫在眉睫。

CD4+T细胞和CD8+T细胞可释放相关细胞因子,在抗鸡球虫感染过程中发挥重要作用。而相关研究表明,Th1类细胞因子IFN-γ在鸡球虫保护性免疫中发挥着主导作用[11,14],IFN-γ可作为细胞因子佐剂增强抗原免疫力[15],接种含有IFN-γ的DNA疫苗能提高鸡肠道免疫力水平并对鸡球虫病有保护作用[16]。用重组IFN-γ处理鸡胚成纤维细胞后,柔嫩艾美耳球虫在细胞内的发育受到了抑制[17]。体内接种重组IFN-γ后可有效减少堆型艾美耳球虫卵囊产量并增加雏鸡体重[18]。IFN-γ还可以刺激巨噬细胞的吞噬作用以及NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤作用,从而在调节抗球虫免疫反应过程中发挥重要作用[19]。因此发现能刺激Th1类细胞因子分泌的分子是研发鸡球虫病新型疫苗的理想候选抗原。

Armadillo/β-catenin样重复序列蛋白(ARM-β)为果蝇体节极性蛋白Armadillo的同源物[20],含有一个大约42个氨基酸的重复偶联序列[21-22],在动物界普遍存在,其在信号传导、发育、细胞黏附和迁移以及肿瘤转移等方面发挥作用[23]。对顶复门原虫研究发现其可激活宿主免疫反应,具有作为疫苗候选抗原的潜力。如Udonsom等[24]发现犬新孢子虫ARM蛋白能被速殖子阳性牛血清所识别,具有显著的特异免疫反应性,提示其可作为防控犬新孢子虫病良好的疫苗候选抗原或药物靶标。Chen等[25]发现EmARM-β免疫雏鸡后,可抵抗巨型艾美耳球虫(Eimeriamaxima,E.maxima)感染。

本课题组前期从E.maxima子孢子cDNA表达文库中筛选到了EmARM-β,发现其能刺激鸡体Th1类细胞因子的分泌,为进一步探究其对鸡免疫细胞功能的影响,将其分别与鸡PBMC、CD8+T细胞及CD4+CD25-T细胞进行共孵育,观察其对上述细胞增殖能力及免疫相关功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒和试验动物E.maximapET-28a-arm-β的菌种及重组质粒保存于南京农业大学兽医寄生虫病实验室。海兰白雏鸡饲养在经灭菌、消毒的无鸡球虫卵囊鸡舍中;自由饮水和采食;饮水及饲料均不含任何抗球虫药物。

1.1.2 主要试剂及仪器His标签蛋白纯化柱为GE Healthcare产品;人外周血淋巴细胞分离液购于天津灏洋公司;Total RNA Extraction Reagent及HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购于Vazyme公司;PerfectStartTMGreen qPCR Super Mix(+DyeⅡ)购于Transgen;ToxinEraserTMEndotoxin Removal Kit为GenScript产品;小鼠抗鸡CD4和小鼠抗鸡CD8α抗体购于Southernbiotech公司;Anti-PE MicroBeads,Anti-FITC MultiSort MicroBeads和磁珠分选系统购于Miltenyi Biotec;CCK-8试剂购自碧云天公司;细胞培养箱、酶标仪和水平离心机购于Thermo Scientific;荧光定量PCR仪为ABI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 EmARM-β重组蛋白(rEmARM-β)的表达及纯化用含有pET-28a-arm-β质粒的菌种表达EmARM-β重组蛋白,超声破碎菌体,获取蛋白样品。将蛋白样品依次用0.8、0.45和0.22 μm的滤器过滤后,使用His标签蛋白纯化柱纯化蛋白,再进行SDS-PAGE凝胶电泳以确定其纯化效果。用内毒素去除试剂盒去除蛋白样品中的内毒素,然后用0.22 μm的滤器过滤除菌,最后用BCA蛋白测定法测定重组蛋白浓度。

1.2.2 rEmARM-β的Western blot验证以E.maxima感染鸡血清(未感染鸡血清作为阴性对照)或His-tag小鼠单克隆抗体作为一抗,HRP标记的山羊抗鸡IgG或HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗,对重组蛋白进行Western blot验证。按如下操作,用SDS-PAGE凝胶电泳分离rEmARM-β,将其转印至PVDF膜。50 g·L-1脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭后将其分别与感染鸡血清(1∶100稀释)和His-tag小鼠单克隆抗体(1∶8 000 稀释)4 ℃孵育过夜,然后将其分别与HRP标记的山羊抗鸡IgG(1∶5 000稀释)和HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000稀释)室温孵育1 h,滴加ECL发光液,在全自动发光成像系统中显影,观察结果。

1.2.3 鸡PBMC的分离及培养用无菌采血管(含4%枸橼酸钠)给健康雏鸡心脏采血,将抗凝血与无菌PBS按1∶1比例(体积比)轻柔混合,将5 mL稀释鸡血沿管壁缓慢加入含有5 mL淋巴细胞分离液的 15 mL 离心管中,室温下500g离心20 min。吸取第2层乳白色淋巴细胞层,并转移至新的15 mL离心管中,用无菌PBS洗涤2次。最后用含有10% FBS和1%青链霉素双抗的RPMI 1640完全培养基重悬细胞,计数细胞,调整细胞密度为1×106mL-1。

1.2.4 鸡CD8+T细胞的磁珠分选分离鸡PBMC,用含有0.5% BSA、2 mmol·L-1EDTA的PBS调整细胞密度为1×108mL-1(PBS使用前需4 ℃预冷),每1 mL加入40 μL藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)标记的小鼠抗鸡CD8α荧光抗体,均匀混合后于4 ℃避光孵育30 min。每1×108个细胞加入10～20 mL的PBS,混匀后300g离心10 min,洗去未结合的抗体。根据Anti-PE MicroBeads说明书加入二抗磁珠,于4 ℃避光孵育15 min,将1×108个细胞加入10～20 mL的PBS,混匀后300g离心10 min,洗去未结合的抗体。用PBS重新调整细胞密度为1×108mL-1,根据磁珠分选系统说明书进行细胞磁珠分选,留在分选柱上的细胞为鸡CD8+T细胞,向分选柱中加入5 mL PBS,并用针芯推尽液体,获得阳性细胞。

1.2.5 鸡CD4+CD25-T细胞的磁珠分选将分离好的鸡PBMC用PBS调整细胞密度为1×108mL-1,每 1 mL 加入40 μL FITC标记的人抗鸡CD25荧光抗体,均匀混合后于4 ℃避光孵育30 min,再加入预冷的PBS,混匀后300g离心10 min,洗去未结合的抗体。根据Anti-FITC MultiSort Kit说明书加入Anti-FITC MultiSort MicroBeads,于4 ℃避光孵育15 min,用PBS洗去未结合的抗体。用PBS调整细胞密度为1×108mL-1,根据磁珠分选系统说明书进行细胞磁珠分选,留在分选柱上的细胞为鸡CD25+细胞,流出细胞为鸡CD25-细胞。用PBS将流出细胞调整细胞密度为1×108mL-1,根据说明书将PE标记的小鼠抗鸡CD4荧光抗体和Anti-PE MicroBeads二抗磁珠依次与细胞孵育后进行细胞磁珠分选,获得鸡CD4+CD25-T细胞。

1.2.6 流式细胞术检测细胞分选纯度将空白细胞、分选前细胞和分选后细胞制成细胞悬液,用流式细胞仪对细胞悬液进行流式检测,检验细胞分选纯度。

1.2.7 rEmARM-β对细胞增殖能力影响用RPMI 1640完全培养基将分离的鸡PBMC以及分选后的鸡CD8+T细胞和CD4+CD25-T细胞调整细胞密度为1×106mL-1,然后铺到96孔细胞培养板上,每孔100 μL。将rEmARM-β以不同质量浓度(10、20、40和80 μg·mL-1)与上述细胞共孵育,并设置PBS阴性对照组和 3 μg·mL-1ConA或2 μg·mL-1LPS阳性对照组。将细胞培养板置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养 24 h,每孔加入10 μL的CCK-8试剂,继续避光培养4 h。同时设置只加入10 μL CCK-8试剂的RPMI 1640完全培养基作为对照组调零。将细胞培养板置于酶标仪,测定450 nm波长处的吸光值。细胞增殖指数以阴性对照组D450值为100%进行计算。

1.2.8 qPCR检测rEmARM-β对鸡PBMC相关细胞因子mRNA表达水平影响将分离的鸡PBMC调整细胞密度为1×106mL-1,铺于12孔细胞培养板,每孔2 mL。将不同质量浓度的rEmARM-β(10、20、40和80 μg·mL-1)与鸡PBMC共孵育6 h,并设置PBS阴性对照组和2 μg·mL-1LPS阳性对照组。收集细胞,采用Trizol法提取细胞总RNA,利用反转录试剂获取cDNA。用于qPCR的细胞因子特异性引物由NCBI的Primer-BLAST设计,并以β-actin作为内参基因。特异性引物及其相关信息见表1。根据说明书配制总体系为10 μL 的qPCR反应体系,包括2×PerfectStartTMGreen qPCR Super Mix(+Dye Ⅱ)5 μL,cDNA模板1 μL,上、下游引物各0.2 μL,Rnase-free ddH2O 3.6 μL。反应程序为94 ℃预变性30 s;循环反应：94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环;熔解曲线建立程序：95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法计算细胞因子mRNA相对表达水平,分析rEmARM-β对鸡PBMC细胞因子mRNA表达水平的影响。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for the quantitative real-time PCR

1.2.9 qPCR检测rEmARM-β对鸡CD8+T细胞和CD4+CD25-T细胞细胞因子mRNA表达水平影响将20 μg·mL-1rEmARM-β与3 μg·mL-1ConA共刺激鸡CD8+T细胞或CD4+CD25-T细胞,并设置ConA+PBS阴性对照组和ConA+2 μg·mL-1LPS阳性对照组。于5% CO2细胞培养箱中37 ℃培养6 h,收集细胞,采用Trizol法提取细胞总RNA,反转录为cDNA,进行qPCR检测。采用2-ΔΔCT法计算细胞因子mRNA相对表达水平,分析rEmARM-β对鸡CD8+T细胞和CD4+CD25-T细胞相关细胞因子mRNA表达水平的影响。特异性引物及其相关信息见表1。

1.2.10 qPCR检测rEmARM-β对鸡CD8+T细胞介导细胞杀伤相关基因mRNA表达水平影响操作步骤同1.2.9节,将收集到的细胞用Trizol法提取细胞总RNA,反转录为cDNA,进行qPCR检测。采用2-ΔΔCT法计算介导细胞杀伤相关基因mRNA相对表达水平,分析rEmARM-β对鸡CD8+T细胞介导细胞杀伤相关基因mRNA表达水平的影响。特异性引物及其相关信息见表1。

1.3 数据的统计分析

使用SPSS 23.0系统软件进行统计和分析,采用one-way ANOVA Duncan’] s法对各组进行组间差异分析。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白EmARM-β的表达、纯化及Western blot验证

对重组蛋白EmARM-β进行表达,其表达情况如图1-A所示,重组蛋白为可溶性蛋白,且随着时间的延长,其表达量越来越高。用His标签蛋白纯化柱对rEmARM-β进行纯化,将纯化前及纯化后蛋白样品进行SDS-PAGE,结果如图1-B。从图中可以看出：rEmARM-β在相对分子质量25×103左右出现单一清晰的目的条带,与预期蛋白相对分子质量一致,表明蛋白纯化效果良好。

图1 rEmARM-β的表达、纯化及Western blot验证Fig.1 The expression,purification,and Western blot identification of rEmARM-β A. rEmARM-β的表达(M. 标准分子质量蛋白;1～2. pET-28a诱导表达0和5 h后产物;3～8. rEmARM-β诱导表达0～5 h后产物)。B. rEmARM-β的纯化(M. 标准分子质量蛋白;1. rEmARM-β纯化前;2. rEmARM-β纯化后)。C. rEmARM-β的Western blot验证(M. 标准分子质量蛋白;1. E.maxima感染鸡血清识别rEmARM-β;2. 阴性鸡血清识别rEmARM-β;3. His-tag小鼠单克隆抗体识别rEmARM-β)。A. The expression of rEmARM-β(M. Standard protein molecular marker;1-2. pET-28a induced by IPTG for 0 and 5 h;3-8. EmARM-β induced by IPTG for 0-5 h). B. The purification of rEmARM-β(M. Standard protein molecular marker;1. rEmARM-β before purification;2. Purified rEmARM-β). C. The Western blot identification of rEmARM-β(M. Standard protein molecular marker;1. The recognition of rEmARM-β by chicken anti-E.maxima serum;2. The recognition of rEmARM-β by negative chicken serum;3. The recognition of His-tag in rEmARM-β by His-tag mouse monoclonal antibody).

分别使用巨型艾美耳球虫感染鸡血清和His-tag小鼠单克隆抗体识别rEmARM-β,从Western blot结果(图1-C)可以看出：感染鸡血清识别出1条相对分子质量为25×103左右的条带(泳道1),这与rEmARM-β的相对分子质量一致;同时His-tag小鼠单克隆抗体也识别出1条相对分子质量为25×103左右的条带(泳道3);作为对照,未感染鸡血清并没有识别出rEmARM-β(泳道2)。

2.2 鸡CD8+T细胞和CD4+CD25-T细胞的磁珠分选

如图2所示：分选前CD8+T细胞占总外周血单个核细胞的比例为16.34%(A2),细胞分选后,比例提高为93.01%(A3);分选前CD4+CD25-T细胞占总外周血单个核细胞的比例为12.14%(B2),细胞分选后,比例提高为88.88%(B3),基本符合后续细胞共孵育试验。

2.3 rEmARM-β对细胞增殖能力的影响

细胞增殖能力检测结果如图3所示：与阴性对照PBS组相比,阳性对照ConA组能显著促进鸡PBMC、CD8+T细胞及CD4+CD25-T细胞的增殖能力(P<0.05)。80 μg·mL-1rEmARM-β能显著促进鸡PBMC的增殖能力(P<0.05);rEmARM-β在各浓度均能显著促进鸡CD8+T细胞及CD4+CD25-T细胞的增殖(P<0.05),且增殖能力随浓度的增加而逐渐加强。

图3 rEmARM-β对鸡PBMC和T细胞亚群增殖能力的影响Fig.3 Effects of rEmARM-β on proliferation of PBMC and T cell subsets PBS：阴性对照组;ConA(LPS)：阳性对照组。采用one-way ANOVA Duncan’] s法对各组进行组间差异分析,字母不相同表示差异显著(P<0.05)。下同。PBS：Negative control group;ConA(LPS)：Positive control group. Differences among groups were analyzed by one-way ANOVA Duncan’] s method;the different letters indicate significant difference(P<0.05). The same below.

2.4 rEmARM-β对鸡PBMC细胞因子mRNA表达水平的影响

如图4所示：与阴性对照PBS组相比,rEmARM-β均可以显著上调鸡PBMCifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-10、il-17a和tgf-β1 mRNA表达水平(P<0.05)。

图4 rEmARM-β对鸡PBMC Th1、Th2、Treg类以及促炎性细胞因子mRNA水平的影响Fig.4 Effects of rEmARM-β on the mRNA levels of Th1,Th2,Treg and proinflammatory cytokines in chicken PBMC

2.5 rEmARM-β对鸡CD8+T细胞和CD4+CD25-T细胞细胞因子mRNA表达水平的影响

如图5所示：与阴性对照PBS+ConA组相比,rEmARM-β可以显著上调鸡CD8+T细胞ifn-γ、il-2和tnf-αmRNA表达水平(P<0.05)(图5-A),显著上调鸡CD4+CD25-T细胞ifn-γ、il-2和tgf-β1 mRNA表达水平,显著下调il-4和il-10 mRNA表达水平(P<0.05)(图5-B)。

图5 rEmARM-β对鸡CD8+T细胞(A)和CD4+CD25-T细胞(B)细胞因子mRNA水平的影响Fig.5 Effects of rEmARM-β on the mRNA levels of cytokines in chicken CD8+T cells(A) and CD4+CD25-T cells(B)PBS+ConA：阴性对照组Negative control group;LPS+ConA：阳性对照组Positive control group.

2.6 rEmARM-β对鸡CD8+T细胞介导细胞杀伤相关基因mRNA表达水平的影响

结果如图6所示：与阴性对照PBS+ConA组相比,rEmARM-β可以显著上调鸡CD8+T细胞穿孔素(pf)、fasl和fas基因mRNA表达水平(P<0.05),对颗粒酶A基因(gram-a)mRNA表达水平差异不显著(P>0.05)。

图6 rEmARM-β对鸡CD8+T细胞介导细胞 杀伤相关基因mRNA水平影响Fig.6 Effects of rEmARM-β on the mRNA levels of mediated cell killing genes in chicken CD8+T cells

3 讨论

鸡球虫病严重威胁家禽的生产福利,对家禽养殖业造成了巨大的经济损失[5,26]。在抗鸡球虫感染过程中,细胞免疫发挥着主导作用[27-28],细胞免疫主要由T淋巴细胞、NK细胞等介导,而CD4+辅助性T细胞(Th细胞)和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)均参与宿主抗鸡球虫感染免疫反应并发挥着重要的作用[29],通过其细胞增殖试验或细胞亚群比例可以初步确定鸡球虫病疫苗的免疫保护效果。CD4+T细胞可通过分泌细胞因子激活NK细胞和巨噬细胞以及自身分泌IFN-γ以抵抗艾美耳球虫感染[30];激活的CD8+T细胞可通过细胞杀伤作用以及分泌IFN-γ和TNF-α等在球虫感染过程中起作用[11,31]。给雏鸡注射抗CD8单克隆抗体后再感染Eimeriatenella和Eimeriaacervulina,发现卵囊排出量明显增加[32]。用抗CD4单克隆抗体处理雏鸡后再感染球虫,同样出现卵囊排出量大幅增加,病变加重等现象[27]。本研究将rEmARM-β分别与鸡PBMC、CD8+T细胞及CD4+CD25-T细胞进行共孵育,发现上述细胞增殖能力均得到显著促进,说明EmARM-β可以有效激活免疫反应。CTL可以通过FasL/Fas和穿孔素/颗粒酶两条途径介导细胞杀伤,而rEmARM-β可以显著上调鸡CD8+T细胞穿孔素(pf)、fasl和fas基因mRNA表达水平,说明其还可以有效促进鸡CD8+T细胞介导的细胞杀伤功能。

Th1类细胞因子主要由活化的CD4+Th1细胞和CD8+T细胞分泌[19,33]。在鸡球虫感染过程中,NK细胞分泌IFN-γ及树突状细胞(DC)和巨噬细胞分泌IL-12,从而诱导Th1细胞分化,Th1细胞进一步分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子介导细胞免疫,抵抗球虫感染[11,19,34-35]。因此Th1类细胞因子及其介导的Th1型免疫反应被认为在抵抗鸡球虫感染中起主要作用[36-37]。在鸡球虫感染过程中,Th2、Th17以及Treg型等免疫反应在肠道免疫反应中也发挥着重要作用[14,38]。IL-4主要由Th2细胞分泌,可以促进Th2细胞的分化[39]。除此之外,促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17A等可以招募炎性细胞,参与炎症反应,并促进Th17细胞的分化,参与Th17型免疫反应,有助于机体对球虫做出反应并消除虫体[40-43]。本研究中,rEmARM-β可以显著促进鸡PBMC、CD8+T细胞及CD4+CD25-T细胞Th1类细胞因子ifn-γ和il-2 mRNA表达水平,可以显著促进鸡PBMC促炎性细胞因子(il-1β、il-6和il-17a)mRNA表达水平,证实了其刺激Th1类细胞因子和促炎性细胞因子分泌的作用。

CD4+T细胞由Th1、Th2、Th9、Th17、Treg(调节性T细胞)和Tfh(滤泡辅助性T细胞)等亚型细胞组成,每种亚型细胞都可以分泌不同类型的细胞因子来帮助机体应对病原体的侵犯[44]。而辅助性T细胞一般指不表达CD25分子的CD4细胞,即CD4+CD25-T细胞。鸡体内的CD4+CD25+T细胞是一种调节性T细胞,其功能为具有免疫抑制作用的免疫细胞,同哺乳动物一样,这些细胞分泌大量的IL-10和TGF-β等Treg类分子[45]。研究表明,低水平的IL-10会增强宿主抵抗病原体的能力[46-47],高水平的IL-10可抑制CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化与增殖[48-49]。在本研究中,利用免疫磁珠分选技术消除掉CD25+细胞,将rEmARM-β与CD4+CD25-T细胞共孵育后,发现CD4+CD25-T细胞的增殖受到促进,il-10 mRNA表达水平受到抑制的现象。有些原虫感染可能已经进化到刺激Treg细胞高分泌IL-10,进一步抑制IFN-γ介导的T细胞反应和巨噬细胞分泌NO,从而抑制宿主抵抗原虫感染[50-53]。rEmARM-β与CD4+CD25-T细胞共孵育后,显著促进了ifn-γ和il-2等Th1类细胞因子的mRNA表达水平而抑制了il-10 mRNA表达水平,进一步验证了其刺激Th1类细胞因子分泌的作用。

本研究证实EmARM-β能有效促进鸡PBMC和T细胞亚群免疫功能,具有研发鸡球虫病新型疫苗候选抗原的潜力。