电针“天枢”与“天枢”配伍“上巨虚”对肠易激综合征大鼠行为学和结肠功能的影响*

刘婷婷,张擎宇,赵香顺,石运来,于燕南,王正文,陈少宗△,杨添淞,5,6△

(1.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040;2.济南医院,济南 250013;3.山东中医药大学针灸推拿学院,济南 250355;4.山东中医药大学针灸研究院,济南 250355;5.黑龙江中医药大学附属第一医院,哈尔滨 150040;6.黑龙江省中医药信息学重点实验室,哈尔滨 150040)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是临床常见慢性胃肠道功能紊乱疾病,发病病因可能与胃肠道功能异常、精神心理刺激等有关[1]。临床症状主要表现为腹痛、腹部不适、大便性状以及排便习惯改变等肠道症状,并伴有心悸、抑郁、焦虑等肠外表现和精神症状[2-3]。IBS发病率呈逐年上升趋势且病程缠绵难愈[4],病因及发病机制尚未完全阐明,目前现代医学根据主要症状进行药物干预治疗,但治疗效果不佳[5-6]。近年来,越来越多的临床研究表明,针灸治疗IBS疗效显著[7],并且优于常规药物[8]。根据课题组前期经验和结果,本实验运用急慢性应激联合方法制备IBS动物模型,以高架十字迷宫、结肠痛敏阈值、血清5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、结肠5-羟色胺4受体(5-hydroxytryptamine 4 receptor,5-HT4R)蛋白表达为指标,初步探讨电针“天枢”配伍“上巨虚”对IBS大鼠模型行为学和结肠功能调节的影响是否具有协同或叠加效应。本实验获得实验动物福利伦理审查委员会的批准,批件编号:SDUTCM20200620001。

1 材料

1.1 动物

选用体质量(200±20)g的雄性清洁级Wistar大鼠,购于济南朋悦实验动物繁育有限公司,动物许可证号:SCXK(鲁)20190003。所有大鼠于山东中医药大学实验中心饲养,保持室内安静,12 h/12 h昼夜节律循环,水和食物均可自由摄取。

1.2 主要试剂

蛋白预制胶(货号:Gel41212),南京艾思易生物科技有限公司;兔抗GAPDH单克隆抗体(货号:10494-1-AP),美国Proteintech公司;5-HT4R多克隆抗体(货号:ab60359),英国Abcam公司;山羊抗兔二抗(货号:SA00001-2),美国Proteintech公司;5-HT 试剂盒(货号:JYM0326Ra),武汉基因美生物科技有限公司。

1.3 主要器材

华佗牌针灸针,0.25 mm×13 mm型,苏州医疗用品厂有限公司;华佗牌电针仪,SDZ-Ⅱ型,苏州医疗用品厂有限公司;冷冻型高通量组织研磨器,宁波新芝生物科技股份有限公司;Eppendorf5425型高速离心机,山东奥恒生物科技有限公司;Multiskan FC型全自动酶标仪,美国Thermofisher公司;Fusion solos S系列化学发光成像系统,德国VILBER LOURMAT公司;伯乐PowerPac Basi型电泳仪,美国Bio-Rad公司;XR-XG201型高架十字迷宫,上海欣软信息科技有限公司;30系列Powerlab实验数据采集分析系统,澳大利亚AD Instruments公司。

2 方法

2.1 模型制备

实验按照随机原则,将大鼠分为空白组(10只)和造模组(45只),造模组大鼠采用慢性应激和急性应激联合法制备IBS模型。参照文献方法[9-10],将大鼠暴露于不同的应激因素:①断食24 h、②昼夜颠倒12 h、③断水24 h、④夹尾5 min、⑤冰水游泳5 min、⑥鼠笼45°倾斜、⑦慢性避水应激1 h,连续干预造模10 d。

2.2 模型评价及分组

造模10 d结束后,运用腹壁撤回反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)半定量评分对造模组大鼠进行模型评价[11-12]。将自制的球囊经导管置入大鼠直肠,深度大约6～7 cm;导管另一端用三通管分别连接血压计和注射器,待大鼠情绪稳定后,进行结直肠扩张刺激和AWR评分。通过注射器缓慢向气囊注入空气,当血压计显示为40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)时停止注入空气,观察大鼠行为反应情况。AWR评分标准[13]:对结肠扩张刺激无行为反应,评为0分;给予刺激大鼠有动作停顿后并见短暂的头部运动行为,评为1分;刺激期间见有腹部肌肉的收缩,评为2分;如有腹部抬起行为,评为3分;身体拱起,并抬起盆腔和阴囊者,评为4分。AWR半定量评分大于等于3分,即判定大鼠造模成功。经过AWR评估其造模成功率可达到55%,将确定制备成功的大鼠随机分为模型组(8只)、天枢组(8只)、天枢配伍上巨虚组(8只)。

2.3 电针干预

穴位定位参考《实验针灸学实验指导》:“天枢”位于神阙穴(剑突与耻骨联合的上2/3与下1/3交点处)旁开 5 mm 处;“上巨虚”位于膝关节后外侧,腓骨小头下约10 mm处[14]。

按照针刺穴位需求的体位(仰卧位)将电针组大鼠固定在自制平台上,选用0.25 mm×13 mm针灸针分别对“天枢”“上巨虚”进行针刺,深度分别为3 mm和5 mm,电针参数设置为2 Hz、1 mA,连续波,1次/d,20 min/次,针刺14 d。空白组大鼠正常喂养,不做任何处理,模型组大鼠仅每天与电针组大鼠使用相同方法进行抓取-捆绑,但不给予电针干预。

2.4 高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)实验

每只Wistar大鼠需要进行3次行为学的检测,即造模前、造模10 d后、14 d电针干预治疗后。实验开始前,减少抓握带来的应激对实验结果产生影响,抓握大鼠实验人员对大鼠抚摸2～3 min,实验开始时,一名实验人员放置好大鼠后迅速远离,大鼠进入高架十字迷宫的同时,另一名实验人员观察视频,记录5 min内大鼠在高架十字迷宫内进入开臂(open arm entry,OE)次数和开臂时间(open arm time,OT),进入闭臂(close arm entry,CE)次数和时间(close arm time,CT)。

依据上述指标并参照相关文献[15],计算开臂进入次数百分比[OE%=OE/(OE+CE)×100%]和开臂停留时间百分比[OT%=OT/(OT+CT)×100%],OE%<20%、OT<25%即判定为大鼠焦虑状态。

2.5 结直肠痛敏阈值测定

第3次行为学实验检测后,对各组大鼠进行结直肠痛敏阈值的检测。此实验开始前,所有大鼠禁食不禁水,以此减少大便的形成。待大鼠腹腔注射麻醉后将其取仰卧位,暴露腹直肌,两根电极丝植入到距腹正中线1.5 cm处;再将自制气囊经大鼠肛门插入6～7 cm处;给气囊缓慢注气后,通过置于腹直肌的两根电极引出肌电信号。运用Powerlab数据采集分析系统,观察并记录两组大鼠在不同扩张压力下腹直肌放电活动。

结直肠痛敏测定[16]:设定结直肠扩张时, 腹直肌放电超过基础放电的10%为有显著反应, 放电明显增加时的结直肠扩张最小压力值即为结直肠痛敏值。

2.6 处死与取材

待大鼠腹外斜肌放电测定后,迅速剪开大鼠胸腔,抽取血液后静置进行离心,-80 ℃冰箱保存备用。待大鼠取血在室温静置过程中,0.9%氯化钠溶液进行灌注,直至大鼠四肢发白,取出结肠并冲净肠容物,-80 ℃冰箱中保存备用。

2.7 ELISA检测血清5-HT含量

测定前使血清样本置于室温中复溶并平衡15～30 min后方可进行实验,每组选取6个血清样本,具体步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.8 Western blot检测结肠组织5-HT4R蛋白表达

采用免疫蛋白印迹法检测各组样本的蛋白表达,每组选取4个结肠组织样本,将各组蛋白上样,电泳60 min,转膜70 min,5%奶粉封闭2 h,清洗3次×10 min,孵育5-HT4R(稀释浓度1∶800)一抗,4 ℃过夜;清洗3次×10 min,孵育二抗(稀释浓度1∶10 000),室温2 h,洗净未结合二抗。ECL试剂盒显影,用凝胶成像系统自动曝光显影。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠EPM测试行为变化比较

与空白组比较,模型组大鼠开臂进入次数百分比(OE%)和开臂停留时间百分比(OT%)明显降低(OE%<20%,OT%<20%,P<0.01),大鼠活动减少,对新环境好奇度降低,出现焦虑症状。与模型组比较,电针天枢组、天枢+上巨虚组大鼠进入开臂时间和次数升高(P<0.01),大鼠焦虑行为明显得到改善。两电针组比较,差异无统计学意义。见图1、图2。

注:横向黑框表示大鼠进入闭臂轨迹;纵向红框表示大鼠进入开臂轨迹图1 各组大鼠高架十字迷宫轨迹图

3.2 各组大鼠结直肠痛敏阈值比较

与空白组比较,模型组大鼠的结肠疼痛阈值(mmHg)明显降低(P<0.01);与模型组比较,天枢组、天枢+上巨虚组大鼠结肠疼痛阈值均明显升高(P<0.01);两电针组比较,差异无统计学意义。见图3。

3.3 各组大鼠血清5-HT含量以及结肠5-HT4R蛋白表达比较

与空白组比较,模型组大鼠血清5-HT含量以及结肠5-HT4R蛋白表达含量分别升高和降低(P<0.05);与模型组比较,天枢组、天枢+上巨虚组大鼠血清5-HT的含量和结肠5-HT4R蛋白含量均得到恢复(P<0.05);两电针组比较,差异无统计学意义。见图4、图5。

注:与空白组比较*P<0.05;与模型组比较#P<0.05;5-羟色胺(5-HT)图4 各组大鼠血清5-HT含量测定(n=6)

注:与空白组比较*P<0.05;与模型组比较#P<0.05;5-羟色胺4受体(5-HT4R)图5 各组大鼠结肠5-HT4R蛋白免疫印迹图及蛋白含量比较(n=4)

4 讨论

根据临床症状,中医学将IBS归属于“泄泻”“便秘”“郁证”等范畴;《灵枢·邪气藏府病形》曰“飧泄,大肠痛,巨虚上廉主之”;《针灸大全》云“腹中寒痛,泄泻不止,里急后重,天枢二穴”。天枢穴(ST25)与上巨虚穴(ST37)分别是大肠募穴和下合穴,是临床治肠易激综合征的重要选穴以及临床治疗肠腑疾病的经典合募配穴[17-18]。现代医学依据神经节段分析,肠道平滑肌活动是受交感神经(T10～L3)和副交感神经(S2～4)的双重支配[17,19-20],支配天枢穴的神经节段在T9～11,上巨虚穴神经支配主要来源于T12～L2神经节段[21],天枢穴和上巨虚穴神经支配与胃肠道的神经支配在脊髓水平有高度重叠性,因此,针灸“天枢”“上巨虚”可将刺激引起的信号投射到支配相应神经节段,实现调理结肠功能的作用。

目前越来越多的临床研究虽显示针灸对IBS身心同调的治疗效果[22-23],但多种因素同时影响针灸干预治疗IBS临床疗效,在多种影响疗效因素中腧穴配伍是关键共性因素之一。课题组前期研究结果显示,单独电针“天枢”对IBS模型大鼠的结肠功能有积极调节作用[24],但关于电针“天枢”配伍“上巨虚”是否有协同或叠加效应的研究较少。

本实验通过急慢性应激联合制备IBS 模型大鼠,利用高架十字迷宫检测IBS大鼠情绪及行为学,腹直肌肌电测定内脏痛敏阈值,ELISA检测血清中5-HT含量以及Western blot法检测结肠组织中5-HT4R蛋白表达,初步探讨电针“天枢”配伍“上巨虚”是否有协同或叠加效应。高架十字迷宫是国际公认的用来测试动物焦虑行为的首选装置[25],用于评估动物行为和心理情绪的实验方法。其原理是利用动物对新环境探究的特性以及嗜暗的天性,当大鼠处在开臂时,相当于人类站在悬崖边上会产生恐惧心理状态[26],同时出于好奇而探究开臂,但又因恐惧心理或者嗜暗本能待在闭臂中,这种相冲突的心理状态造成“探究-回避”行为,大鼠进入开臂次数和开臂时间百分比则反映大鼠焦虑情绪[27]。目前认为IBS病理和生理过程包括肠道分泌、感觉以及动力异常,临床研究发现,IBS患者肠道功能紊乱与5-HT异常有关[28]。5-HT,又名血清素,是一种脑肠肽神经递质,大部分的5-HT产生并贮存于肠嗜铬细胞 (enterochromaffin cell,EC)中,少部分在中枢神经系统合成,EC释放的5-HT既可通过刺激肠肌间神经丛或黏膜下层的不同受体(5-HT3、5-HT4)调节胃肠道的蠕动和分泌,影响胃肠动力和增加内脏敏感性[29],同时参与中枢神经系统中对精神情志的调控[30-32]。5-HT4R蛋白通过刺激神经末梢使运动神经元释放乙酰胆碱以及其他神经递质,从而影响结肠感觉和运动功能[31],形成一系列排便异常、腹部不适等IBS临床症状。

各组大鼠高架十字迷宫实验结果显示:与空白组相比,模型组大鼠OE%和OT%明显减少,与模型组相比,两电针组OE%和OT%升高,说明电针可缓解IBS大鼠模型焦虑的情绪心理行为,与临床和基础究结果相一致[32-33]。腹直肌肌电检测结肠痛敏阈值的结果、血清5-HT含量、5-HT4R蛋白表达实验结果显示:与模型组比较,电针“天枢”与“天枢”配伍“上巨虚”均能提升大鼠内脏痛敏阈值,减少血清5-HT含量,增加5-HT4R蛋白含量表达,说明电针可调节IBS大鼠结肠功能紊乱症状,与同类研究的结果相一致[34-35]。但以上实验结果还显示,与电针“天枢”相比,电针“天枢”配伍“上巨虚”并未显示腧穴配伍优势,差异无统计学意义。

综上所述,电针“天枢”与“天枢”配伍“上巨虚”对IBS模型大鼠行为学以及结肠功能异常症状均有调节作用,但电针“天枢”配伍“上巨虚”未表现明显治疗优势,因而就本实验结果而言从侧面显示出电针对IBS模型大鼠精神心理行为以及结肠功能的调节作用与腧穴数量多少无关。产生此结果的原因可能是由于IBS病因病机涉及众多的病理和生理环节,而本实验只是观察电针“天枢”与“天枢”配伍“上巨虚”对IBS模型大鼠精神心理行为、血清5-HT以及结肠5-HT4R蛋白含量等指标的影响,并未涉及其他的发病机制中相关指标的研究。除此之外,由于针刺的效应机制涉及多个途径和作用靶点[36],“天枢”配伍“上巨虚”可能通过各自不同的作用靶点产生叠加效应。因此,穴位之间的协同或叠加效应不是腧穴之间简单相加[37],腧穴配伍协同作用或者腧穴组方规律有待进一步研究。