Box- Behnken响应面法结合多指标综合评分法优化俄色叶(变叶海棠)配方颗粒的提取工艺

蒋孟莲，徐俊，颜雨豪，杨转珍，杨永泓，康晋梅，陈怡璇，蔡晓洋，李敏

(成都中医药大学 药学院/现代中药产业学院/省部共建西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137)

藏药材俄色叶为蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malus toringoides (Rehd.)Hughes或花叶海棠Malus transitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶及叶芽[1]，具有攻坚化积、除腻涤滞、保肝利胆的功效，为甘孜藏族自治州民间的一味药食两用药材，其药用和食用历史悠久。俄色叶药材始载于《四部医典》[2]，现已被《四川省藏药材标准》(2014年版)[1]收载。俄色叶中主要含有黄酮类成分，变叶海棠叶中总黄酮含量高于花叶海棠，且变叶海棠在四川省甘孜州地区的资源蕴藏量远大于花叶海棠，综合成分含量和资源蕴藏量，为保证俄色叶的可持续发展，因此本研究选择变叶海棠为研究对象。目前从俄色叶中已分离鉴别出20余种化合物，其黄酮类成分主要包括金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素、芦丁、紫云英苷[3- 5]等。其中根皮苷、根皮素、槲皮素具有降血糖、抗氧化、保肝[6- 8]、降血脂[9- 10]等作用。俄色叶中总黄酮含量约为同科属植物西府海棠叶中的2倍[11]，其根皮苷含量约为湖北海棠叶中的6倍[12]，为尖嘴林檎叶中的33倍[13]。因此俄色叶的主要活性成分为黄酮类成分。

随着中药配方颗粒需求日益增高，国家食品药品监督管理总局制定了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，对中药配方颗粒的制备工艺进行整体规定。但是各个生产企业仅根据自身的经验和企业现有的设施、辅料等进行具体品种生产，没有统一生产工艺参数，导致企业生产的同品种配方颗粒在规格、疗效上存在差异[14]。因此对中药配方颗粒制备工艺进行研究，并建立具体品种生产工艺具有重要意义，从而保障药品质量稳定和疗效。因此，本研究采用单因素结合Box- Behnken响应面法，筛选俄色叶(变叶海棠)配方颗粒的最佳提取工艺，为配方颗粒质量标准研究奠定基础。

1 实验材料与设备

1.1 实验材料

俄色叶(变叶海棠)药材采集自四川省甘孜州炉霍县，净制去除枝干杂质得到俄色叶(变叶海棠)饮片，经成都中医药大学李敏教授鉴定为蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malustoringoide(Rehd.)Hughes.的干燥叶。

1.2 试剂

绿原酸(批号：Wkq20042702，四川省维克奇生物科技有限公司)、金丝桃苷(批号：Wkq21021904，四川省维克奇生物科技有限公司)、异槲皮苷(批号：Wkq21061105，四川省维克奇生物科技有限公司)槲皮苷(批号：Wkq21022402，四川省维克奇生物科技有限公司)、根皮素(批号：Wkq21020808，四川省维克奇生物科技有限公司)、根皮苷(批号：Wkq20070810，四川省维克奇生物科技有限公司)、槲皮素(批号：Wkq20061112，四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均大于98%。乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水。

1.3 仪器

UltiMate3000高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；BP121S旋转蒸发仪(德国Sartorius公司)；MD- DG30E103全自动煎药壶(潮州市一壶百饮电器实业有限公司)；BP121S十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；KQ- 500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SCIENTZ- 20F/A冷冻干燥机(宁波新芝)。

2 实验方法

2.1 俄色叶(变叶海棠)配方颗粒提取工艺评价指标

俄色叶(变叶海棠)配方颗粒提取工艺采用多指标综合评价法对9个质量指标进行综合评分，综合分析筛选出最佳参数，其中出膏率(X1)、总黄酮(X2)、根皮苷(X3)、根皮素(X4)、绿原酸(X5)、金丝桃苷(X6)、异槲皮苷(X7)、槲皮苷(X8)、槲皮素(X9)为指标，以各指标质量分数的最大值作为参照对数据进行标准化处理，得到综合评分公式：综合得分(Y)=(X1/X1max)×0.2+(X2/X2max)×0.2+(X3/X3max)×0.3+(X4/X4max)×0.05+(X5/X5max)×0.05+(X6/X6max)×0.05+(X7/X7max)×0.05+(X8/X8max)×0.05+(X9/X9max)×0.05。总黄酮含量参照俄色叶中药标准(SCYPBZ2021- 001)项下总黄酮的测定方法[1]。绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素7种成分含量参照课题组前期建立的含量测定方法[15]进行测定。

2.2 7种黄酮类成分含量测定方法

2.2.1 色谱条件

色谱条件 Insertsil ODS- 3 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm )；流动相乙腈(A)- 0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0- 5 min，12%- 15%A；5- 15 min，15%- 20% A；15- 28 min，20% A；28- 48 min，20%- 42% A；48- 50 min，42%- 50% A；50- 55 min，50%- 12% A)；体积流量0.7 mL/min；柱温30℃；检测波长340 nm；进样量10 μL。

2.2.2 对照品溶液制备

取绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素各对照品适量，精密称定，分别置于不同25 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并定容，制备各单一对照品母液。分别取一定量的各对照品母液，置于同一10 mL量瓶中，用75%甲醇稀释制成绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素质量浓度分别为0.125 mg/mL、0.35 mg/mL、0.86 mg/mL、0.38 mg/mL、9.3 mg/mL、0.01 mg/mL和0.85 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取俄色叶药材细粉(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声(功率：500 W，频率：40 kHz)处理45 min，放冷，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 系统适应性试验

按照“2.2.1”项下色谱条件测定混合对照品溶液、俄色叶供试品溶液和阴性样品溶液，结果表明样品中各成分分离度和理论板数均较好，且阴性无干扰，见图1。

注:A- 混合对照品,B- 俄色叶样品,C- 阴性对照;1- 绿原酸,2- 金丝桃苷,3- 异槲皮苷,4- 槲皮苷,5- 根皮苷,6- 槲皮素,7- 根皮素

2.3 单因素试验

2.3.1 浸泡时间考察

参考标准汤剂的制备方法，取俄色叶饮片50 g，按料液比1：15，提取时间30 min，提取次数2次，分别考察浸泡0 min、15 min、30 min、45 min、60 min对提取效果的影响，结果见表1。由表可知，浸泡30 min后，各成分变化微弱，故确定30 min为最佳浸泡时间。

表1 不同浸泡时间考察 %

2.3.2 料液比考察

取俄色叶饮片50 g，浸泡30 min，提取时间30 min，提取次数2次，分别考察料液比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30对提取效果的影响，结果见表2。

表2 不同料液比考察 %

表3 不同提取时间考察 %

由表可知，随着提取时间的增加，综合评分呈现先升高后降低的趋势，在提取60 min时综合评分最高，故确定60 min为最佳提取时间。

2.3.4 提取次数考察

取俄色叶饮片50 g，按料液比1∶15，浸泡30 min，提取45 min，分别考察提取次数1次、2次、3次对提取效果的影响，结果见表4。

表4 不同提取时间考察 %

由表可知，随着提取次数的增加，综合评分逐渐升高，提取次数为3次时，综合评分最高，故选择3次为最佳提取次数。

综合单因素实验结果，初步确定提取工艺参数为取俄色叶饮片加水煎煮两次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮60 min；第二次加13倍量水，煎煮60 min；第三次加13倍量水，煎煮60 min，滤过，即得。

2.4 响应曲面试验

2.4.1 Box- Behnken响应曲面试验

响应曲面试验以浸泡时间(X1)、料液比(X2)、提取时间(X3)、提取次数(X4)4个因素作为自变量，利用Design- Expert8.0.6软件按照Box- Behnken的中心组合实验设计，选择5个中心实验点，得到29个实验点，进行4因素3水平试验。以综合评分为响应值，通过响应面分析提取工艺的优化，得到最佳提取工艺，实验设计见表5，实验结果见表6。

表5 因素设计表

表6 Box- Behnken实验结果

以提取工艺中综合得分为因变量，对浸泡时间、料液比、提取时间、提取次数各因素进行多元回归拟合，得到二项式拟合的复相关系数r2=0.8872，模型P<0.05，达显著水平，说明模型拟合度良好，使用此方程可以代替真实的试验点进行分析。由表7可知，回归方程失拟性检验P=0.1913>0.05，无显著性差异，说明该方程与实际情况拟合良好，模型的残差可能是随机误差产生，可用此模型来分析预测最佳提取工艺。由方差分析得到多元回归拟合方程为综合得分=0.71-0.011A+0.013B+5.912E-003C+0.089D+0.024AB+0.029AC-0.045AD+5.639×10- 3BC+5.684×10- 3BD-0.046CD-0.016A2+0.035B2+8.531×10- 3C2-0.027D2。

表7 响应面方差分析

从F值的大小可知，单因素对提取的影响顺序为D>B>A>C，即提取次数>料液比>浸泡时间>提取时间；且回归模型中1次项A、B、C不显著，D显著；2次项均显著；交互项AB、AC、BC、BD不显著，AD、CD显著，说明不同的提取工艺与综合得分之间不是简单的线性关系。通过DesignExpert8.0.6软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析，绘制响应面曲线图，响应曲面陡峭程度越大，则对综合得分的影响也越大，结果见图2。

图2 基于响应曲面法不同因素对综合得分的影响

根据响应曲面结果筛选出最佳提取工艺为按料液比1：15加水，浸泡27.85 min，提取3次，每次45 min。结合实际生产能耗和其他生产成本控制因素，以及最接近标准汤剂原则，确定更合理的提取工艺，将最佳提取工艺条件修正为取俄色叶饮片加水煎煮两次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，滤过，即得。

2.5 提取工艺验证试验

根据“2.3.1”优选出的最佳工艺制备3批样品，测定样品中多种成分的含量，并进行综合评分，见表8。由最佳提取工艺所得提取液的测定结果可知，实测OD值与预测值0.938的相对误差较小(3.08%)，表明本实验所建立的回归模型准确可靠，优化得到的最佳加工工艺重现性好。

表8 验证试验结果 %

3 讨论

3.1 俄色叶(变叶海棠)标准汤剂及配方颗粒指标成分的选择

目前《四川省藏药材标准》(2014年版)中仅对俄色叶项下总黄酮和根皮素含量做出规定，但研究表明，俄色叶中已能分离鉴别出20余种化合物[16]，其黄酮类成分根皮苷、根皮素、槲皮素具有多种重要生物活性，因此黄酮类成分的含量对保证俄色叶药材质量和药效十分重要。本实验选择绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素这7个黄酮类成分作为评价指标，能够更好地评价俄色叶(变叶海棠)配方颗粒的提取工艺。

3.2 俄色叶(变叶海棠)配方颗粒提取工艺的确定

本实验首先采用单因素实验对俄色叶配方颗粒提取工艺的浸泡时间、提取时间、料液比、提取次数四因素进行考察，初步确定为浸泡30 min，料液比1：15，提取时间60 min，提取次数3次。标准汤剂制备工艺研究表明饮片的吸湿率为200%，故在对料液比进行考察时，针对饮片吸湿对水的损耗，第二次加水量均在第一次加水的基础上减少2倍水。随后采用响应曲面法对筛选出的提取工艺进行综合实验，分析不同因素对配方颗粒提取率的综合影响，结合现代实际生产情况，对正交实验确定的条件进行修正为取俄色叶饮片加水煎煮两次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，滤过，即得。

综上分析，本文采用单因素结合Box- Behnken响应曲面实验，以7种黄酮类成分含量、总黄酮、出膏率的综合评分为考察指标，优选俄色叶(变叶海棠)配方颗粒最佳提取工艺为：加水煎煮两次，第一次加15倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min；第二次加13倍量水，煎煮45 min，滤过，合并煎液。四川省藏药资源丰富，而且在许多高原疾病上面具有显著优势，但是目前许多藏药的研究开发仍较为薄弱，需要加强对其化学成分、作用机制等方面的研究[17]。本文仅对俄色叶(变叶海棠)配方颗粒的提取工艺进行了研究，后续还需建立其配方颗粒的质量标准评价方法，以完善整个俄色叶(变叶海棠)配方颗粒的质量控制体系。