普通小球藻对水体NH4+-N、NO2−-N去除效果及NO2−-N的同化途径

沈 雷， 高建操， 聂志娟， 郑兆伟， 胡佳雯，邵乃麟， 孙 毅， 徐钢春,,*

(1. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏 无锡 214081；3. 南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081)

氨氮(主要为非离子氨)、亚硝酸盐氮是养殖水体中主要的毒害物质，对水产动物生存环境有至关重要的影响。水体中非离子氨与离子氨能够相互转化；水温或pH越高，水中非离子氨的含量也越高。而水体中NH4+-N和NO2−-N浓度过高会造成养殖动物免疫力下降、发生病害甚至死亡[1-5]。因此，去除养殖水体中NH4+-N和NO2−-N对于保证养殖动物的健康意义重大[6-7]。

对于养殖水体NH4+-N和NO2−-N的升高，生产中常用化学氧化剂缓解。化学方法虽在短期内具有较好的去除效果，但同时会影响水体微生物群落组成，扰乱池塘生态平衡[8-11]。随着生态理念的推广和绿色养殖技术的普及，越来越多的养殖户选择微生态制剂调控水质及改良底质；在循环水养殖系统(RAS)等工厂化养殖中尤为明显[12-13]。除微生物外，藻类作为池塘中的初级生产者，对维护养殖池塘生态平衡同样具有重要的作用。

普通小球藻(Chlorella vulgaris)作为单细胞浮游植物，以其繁殖迅速、生命力强被水产界广泛使用[14-16]。目前，多项研究关注小球藻对NH4+-N和NO2−-N的去除效果，而忽略了二者之间的关联[17-20]；而实际养殖水体中NH4+-N、NO2−-N同时存在，两者之间存在协同和转化。近年来，多数研究表明小球藻具有净化养殖水体的功能，但不同种类的小球藻去除NH4+-N、NO2−-N效果不尽相同。刘祥等[21]研究发现普通小球藻在自养模式下无法去除NH4+-N。而许元钊等[22]发现索罗金小球藻(C. sorokiniana)能够去除NH4+-N，但无法去除NO2−-N。我国常见的小球藻种类有普通小球藻、蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)和椭圆小球藻(C.ellipsoidea)等，其中普通小球藻是水产养殖中广泛使用的一种。因此，揭示普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N去除效果及相关影响因子对于水产健康养殖意义重大。

目前，小球藻对水体中NH4+-N去除途径研究的比较透彻，主要为小球藻直接同化吸收以及水体中pH变化导致NH4+-N挥发[23-24]；而有关小球藻去除水体中NO2−-N的研究较少。这也导致了养殖池塘亚硝酸盐浓度偏高时，养殖户缺乏有效的生态应对措施。本研究以普通小球藻为研究对象，检测了普通小球藻对水体中NH4+-N、NO2−-N的去除效果和规律，同时探究了普通小球藻同化水体中NO2−-N潜在途径。本研究结果将有助于进一步加深对小球藻去除NO2−-N效果和途径的认知，为小球藻在水产养殖中的科学使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

普通小球藻由实验室制备，接种于新鲜无菌的BG-11培养基，于光照4500 lx、光暗比12 h/12 h、温度26 ℃下恒温培养，达到对数生长期的高密度藻液用于实验。实验水体由水产饲料在自来水中自然释放氮营养盐制得；实验容器为3 L玻璃烧杯。

1.2 实验方法

将藻母液置以3500 r/min离心10 min后，弃去上清液，用蒸馏水反复洗涤3次，去除藻液中营养盐。饲料废水置以5000 r/min离心5 min后，取上清液用于实验。实验温度为28 ℃，曝气量为2 L/min，连续曝气与光照。

不同条件下小球藻对NH4+-N、NO2−-N的去除效果实验取饲料废水15 L，充分混匀后分成15份，实验组添加普通小球藻至初始密度为2.5×105个/mL，光照强度为18000 lx。设置A组∶对照，B组∶普通小球藻，C组∶普通小球藻＋曝气，D组∶普通小球藻＋光照，E组∶普通小球藻＋光照＋曝气，每组3个平行，每隔12 h检测各组水体中NH4+-N、NO2−-N质量浓度及小球藻细胞密度。

不同光照强度下普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N的去除效果实验取饲料废水15 L，充分混匀后分成15份，添加普通小球藻至初始密度为2.5×105个/mL，设置不同光照强度组∶0 lx(A组)、3000 lx (B组)、6000 lx (C组)、9000 lx(D组)和18000 lx (E组)5个组，每组3个平行，给予曝气条件，每隔12 h检测水体中NH4+-N、NO2−-N质量浓度及藻细胞密度。

不同初始密度的普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N的去除效果实验取饲料废水12 L，充分混匀后分成12份，设置初始藻密度分别为对照(0)、低密度(5.0×104个/mL)、中密度(2.5×105个/mL)、高密度(1.25×106个/mL) 4个组，每组3个平行，给予18000 lx光照与曝气条件，每隔12 h检测水体中NH4+-N、NO2−-N质量浓度及藻细胞密度。

曝气对亚硝酸钠溶液中NO2−-N浓度的影响实验准确称取0.4928 g亚硝酸钠(分析纯)，溶解于超纯水，定容至1 L，制成NO2−-N质量浓度为0.100 mg/mL的标准液。分别取1、3 和5 mL标准液，用纯水稀释配置成质量浓度分别为0.1、0.3和0.5 mg/L的NO2−-N溶液，给予18000 lx光照与曝气条件，每隔6 h检测水体中NO2−-N含量。

普通小球藻处理下NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N质量浓度的变化规律实验取饲料废水6 L，经高压蒸汽灭菌后充分混匀分成6份，3份添加普通小球藻为实验组，设置初始藻密度为5.0×105个/mL，对照组不添加普通小球藻。给予18000 lx光照与曝气条件，每隔6 h检测水体中NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N质量浓度及藻细胞密度。并分别在6 h (NH4+-N吸附过程)和24 h(NO2−-N吸附过程)时检测普通小球藻亚硝酸盐还原酶(NiR，江苏酶免实业有限公司)活性。

1.3 水质测定

NH4+-N测定采用纳氏试剂分光光度法，NO2−-N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，NO3−-N采用紫外分光光度法[25]，溶解氧(DO)和pH采用水质分析仪测定(Thremo Orion Star A329; Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, 美国)。普通小球藻采用血球计数板计数。去除率r计算公式∶

式中，C0和C1分别为某时刻对照组与处理组浓度(mg/L)。

1.4 数据分析

结果以平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0软件进行方差分析与回归分析，其中P＜0.05和＊表示差异显著，P＜0.01和＊＊表示差异极显著。采用Microsoft Excel 2019软件绘图，其中组内时间上差异显著性用大写字母标注，组间差异用小写字母标注。

2 结果

2.1 不同条件下普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N去除效果及藻密度变化

无光照组间NH4+-N含量无显著差异(P＞0.05)，而有光照组从第12小时开始 NH4+-N含量显著低于无光照组(P＜0.05)；在第24和48小时，E组NH4+-N去除率显著高于D组(P＜0.05；表1)；表明光照是普通小球藻去除NH4+-N的必要条件，而曝气对NH4+-N的去除有一定的促进作用。

表1 不同条件下小球藻去除NH4+-N、NO2−-N效果及藻密度变化Tab. 1 Removal effects of NH4+-N and NO2−-N by C. vulgaris under different conditions and the changes of algal density

无光照组NO2−-N含量有随时间逐步上升的趋势，而D、E组NO2−-N含量分别在第36和24小时显著低于无光照组(P＜0.05；表1)；与D组相比，E组在24～72 h具有更高的NO2−-N去除率。综上表明，普通小球藻对NO2−-N去除明显滞后于NH4+-N的去除；合适的光照条件下，普通小球藻能有效去除NO2−-N，同时曝气可以显著提高普通小球藻对NO2−-N的去除速率与去除率(P＜0.05)；在缺乏光照的条件下，曝气会诱导NO2−-N产生。

光照组普通小球藻数目迅速增加且显著高于无光照组(P＜0.05；表1)；E组藻密度略高于D组；说明光照充足时，普通小球藻能快速利用水体营养物质进行增殖，曝气对普通小球藻生物量的增加有一定的促进作用。

2.2 不同光照强度下普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N去除效果及藻密度变化

自实验开始，各处理组NH4+-N含量均显著低于A组(P＜0.05)，B、C、D三组在0～24 h随光照强度增加，NH4+-N去除速率显著加快(P＜0.05)，D组与E组无显著差异(P＞0.05)；36 h后各处理组NH4+-N去除率无显著差异(P＞0.05；表2)；表明光照强度增加有利于提高NH4+-N去除速率，光照强度为9000 lx时即有较好的NH4+-N去除效果。在第48小时时，E组具有最高的NH4+-N去除率，为96.23%(表2)；经回归分析，NH4+-N去除率(Y)与时间(X1)、光照(X2)关系∶YNH4＋-N=1.189X1+5.79×10−4X2+24.158，R2=0.664。

表2 不同光照强度下小球藻去除NH4+-N、NO2−-N效果及藻密度变化Tab. 2 Removal effects of NH4+-N and NO2−-N by C. vulgaris under different light intensities and the changes of algal density

B、C、D、E组NO2−-N含量分别从第60、36、24和24小时显著低于A组(P＜0.05)，且E组NO2−-N去除率在第36小时显著高于D组(P＜0.05)；表明NO2−-N去除速率随光照强度增加而加快。在第60小时时，D组具有最高的NO2−-N去除率，为99.19%(表2)；经回归分析，NO2−-N去除率(Y)与时间(X1)、光照(X2)关系∶YNO2−-N=1.562X1+1.909×10−3X2−26.078，R2=0.762。

A组藻密度未显著升高，而B、C、D、E组藻密度自实验开始即快速上升，分别在第60、60、36和24小时达到平台期(表2)。表明在充足的营养条件下，随着光照强度增加，微藻繁殖速率加快。

2.3 不同普通小球藻密度去除NH4+-N、NO2−-N效果及藻密度变化

对照组NH4+-N含量逐步下降，低、中、高密度组NH4+-N含量分别在第24、12和12小时显著低于对照组(P＜0.05)，且高密度组NH4+-N去除率显著高于中密度组(P＜0.05)；表明NH4+-N去除速率随藻密度增加而加快。在第24小时中密度组具有最高的NH4+-N去除率，为94.92%(表3)；经回归分析，NH4+-N去除率(Y)与时间(X1)、藻密度(X3)关系为YNH4＋-N=0.888X1+1.02×10−5X3+32.555，R2=0.408。

表3 不同普通小球藻密度去除NH4+-N、NO2−-N效果及藻密度变化Tab. 3 Removal effects of NH4+-N and NO2−-N by C. vulgaris at different densities and the changes of algal density

低、中、高密度组NO2−-N含量分别在第48、24和24小时显著低于对照组，中、高密度组之间无显著差异(P＜0.05)；表明藻密度为2.5×105个/mL即有较好的NO2−-N去除效果。在第60小时，中密度组具有最高的NO2−-N去除率，为99.05%(表3)；经回归分析，NO2−-N去除率(Y)与时间(X1)、藻密度(X3)关系为YNO2−-N=1.746X1+1.64×10−5X3−17.250，R2=0.613。

三个处理组藻密度均逐渐上升(表3)，低密度与中密度组在第48小时达到平台期；高密度组在第24小时达到平台期，36 h后开始下降；中密度组藻密度在第48～72小时显著高于其他2组(P＜0.05)，其他2组之间无显著差异(P＞0.05)。综上，在充足的营养条件下，微藻繁殖速度随藻密度增加而加快，而营养缺乏时，微藻生物量会迅速下降。

2.4 曝气对NO2−-N的去除效果及水体溶解氧(DO)变化

图1-a为曝气对NO2−-N的去除效果，3种浓度NO2−-N均未呈现出下降趋势。而12 h后溶解氧含量达到9 mg/L以上(图1-b)，说明短时曝气无法去除NO2−-N，即空气中的氧气无法直接氧化NO2−-N。3组DO变化趋势一致，先快速上升，随后在平台期上下波动(图1-b)。

图1 曝气对不同初始浓度NO2−-N含量、溶解氧的影响不同大写字母表示组内不同时间点指标差异显著(P＜0.05)，下同。Fig. 1 Effects of aeration on NO2−-N content and dissolved oxygen at different initial concentrationsDifferent uppercase letters indicated temporal differences in a given group(P＜0.05), the same below.

2.5 普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N的去除效果及其变化规律

藻组NH4+-N、NO3−-N、NO2−-N含量分别从0、12和18 h后开始下降(图2-a～c)；最高去除率分别为94.73%、92.24%和98.99%(表4)。表明普通小球藻能有效去除氮无机盐，去除顺序为NH4+-N＞NO3−-N＞NO2−-N。结合0～12 h藻组溶解氧含量迅速升高(图2-d)，而此时间段NO3−-N、NO2−-N浓度均未发生显著变化，表明普通小球藻光合作用产生的氧气无法将NO2−-N氧化成NO3−-N。

图2 普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N与NO3−-N去除效果及水体中DO、pH、藻密度变化“*”表示同一时间点各处理组间差异显著(P＜0.05)，“**”表示同一时间点各处理组间差异极显著(P＜0.01)，下同。Fig. 2 Removal effects of C. vulgaris on NH4+-N, NO2−-N and NO3−-N and the changes of DO, pH and algae density in water"*" means significant difference between treatment groups at the same time point (P＜0.05), "**" means extremely significant difference between treatment groups at the same time point (P＜0.01), the same below.

表4 普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N与NO3−-N的去除率变化Tab. 4 Removal rates of NH4+-N、NO2−-N与NO3−-N by C. vulgaris %

实验期间，普通小球藻数目逐步上升(图2-f)，藻组与对照组DO、pH均显著上升(P＜0.05)，但藻组上升幅度大于对照组，其中藻组DO含量在12～30 h均显著高于对照组(P＜0.05；图2-d)，藻组pH在6～30 h均显著大于对照组(P＜0.05；图2-e)。综上，普通小球藻利用氮盐繁殖时有利于提高水体DO与pH。

2.6 NH4+-N、NO2−-N下降过程中普通小球藻亚硝酸盐还原酶活性变化

第6和24小时分别为NH4+-N与NO2−-N下降过程，小球藻细胞内亚硝酸盐还原酶活性分别为(56.59±3.56) ng/L和(130.62±7.41) ng/L，二者差异显著(P＜0.05；图3)。实验结果表明，普通小球藻细胞内存在亚硝酸盐还原酶，NO2−-N可能在该酶的作用下被还原成氨氮，由此造成24～30 h氨氮去除率轻微下降(表4)。

图3 NH4+-N、NO2−-N下降过程中普通小球藻亚硝酸盐还原酶活性变化Fig. 3 Changes of nitrite reductase activity during NH4+-N and NO2−-N descending process

3 讨论

3.1 普通小球藻对水体中无机氮的去除

本研究发现在适宜的光照条件下，普通小球藻能有效去除氮营养盐，充足的碳源可能是必要保障。光照条件下，曝气能够提高藻对NO2−-N的去除速率，可能是CO2作为额外碳源增加了水体碳氮比，削弱了普通小球藻繁殖的碳限制[26-27]。类似地，王玮蔚等[28]发现，随着HCO3−浓度的增加，普通小球藻生长逐渐加快。研究表明，普通小球藻在光照下能利用无机碳源进行自养繁殖，同时普通小球藻还能够直接利用葡萄糖、D-果糖等有机碳源进行异养繁殖[29-30]。Babaei等[31]以葡萄糖为碳源，在黑暗环境中异养培养普通小球藻能有效去除NH4+-N。综上，在生产上同时提供无机和有机碳源可能加速小球藻去除无机氮的效果，但具体效果还需要进一步的研究。

与Syrett[32]研究结果一致，本研究发现普通小球藻对NH4+-N、NO2−-N、NO3−-N均具有较强的去除能力，且普通小球藻利用氮营养盐顺序为NH4+-N＞NO3−-N＞NO2−-N。在前人的研究中也有不同的报道，杨坤等[33]研究小球藻净化养殖水体水质时，发现NO3−-N无法去除。刘娥等[34]利用菌藻系统处理水产养殖尾水时，发现单藻条件下无法去除NO2−-N。秦璐等[35]研究小球藻对罗非鱼养殖水体水质的影响，结果表明小球藻对NO2−-N与NO3−-N均无显著去除效果。上述研究与本研究结果不符的原因在于普通小球藻利用氮盐具有选择性，当水体中NH4+-N持续存在时，普通小球藻仅优先利用NH4+-N，导致NO2−-N、NO3−-N去除效果不显著。然而，刘梅等[36]利用蛋白核小球藻净化凡纳滨对虾养殖废水，发现蛋白核小球藻优先去除NO2−-N与NO3−-N，这可能是由于NH4+-N浓度超出了藻类的理想吸收范围导致的；Ohmori等[37]研究表明，氨氮浓度降低到一定浓度时，微藻对氨氮的吸收速率显著提高。

3.2 光照强度与初始藻密度对NH4+-N、NO2−-N的去除效果

本实验中对照组NH4+-N含量降低与曝气导致的NO2−-N含量升高，可能是NH4+-N挥发与被氧化所致[38-40]。在有氧环境下，亚硝酸细菌将NH4+-N氧化成NO2−-N，而硝酸细菌繁殖周期相对较长，不能及时将NO2−-N氧化成NO3−-N，因此导致NH4+-N降低与NO2−-N堆积[41-42]。

与郑娇莉等[43]研究结果相似，本实验结果显示，光照强度为18000 lx时NH4+-N去除率可达96.23%，接种初始藻密度为2.5×105个/mL 时NH4+-N去除率达94.92%，而对NO2−-N去除率均接近100%；效果优于刘盼等[18]、杨坤等[33]与焦蓉婷等[44]实验中NH4+-N和NO2−-N的去除效果，表明藻类去除氮盐效果与藻种类、环境等密切相关。本研究表明，在18000 lx时NH4+-N去除率最高，在9000 lx时NO2−-N去除率最高，初始藻密度在2.5×105个/mL时对NH4+-N、NO2−-N去除率最高，但光照与藻密度交互作用对氮盐的去除效果尚需进一步研究。

3.3 NO2−-N的同化途径

本研究显示，曝气条件下溶解氧含量达到9 mg/L以上NO2−-N含量未发生显著变化，同时在普通小球藻快速产氧期(0～12 h)时水体中NO2−-N与NO3−-N含量未发生显著变化，表明氧气无法氧化NO2−-N，这可能与NO2−-N自身具有一定强度的氧化性有关[45-46]。在生产中，开增氧机能降低养殖池塘NO2−-N含量，其原因可能是硝化细菌将NO2−-N氧化所致，因为在有氧环境中硝化细菌能够加速将NO2−-N氧化至NO3−-N[47]。本实验中NH4+-N下降阶段(6 h)亚硝酸盐还原酶活性较低[(56.59±3.56) ng/L]，而在NO2−-N下降阶段(24小时)亚硝酸盐还原酶活性升高了2.3倍。因此，本实验中小球藻去除NO2−-N的机理∶藻细胞内亚硝酸盐还原酶将NO2−-N还原成NH4+-N进而被同化吸收。

3.4 普通小球藻对水体DO、pH影响及藻密度变化

藻类通式为C106H263O110N16P[48]，与其他藻类一样，普通小球藻的扩增同时需要碳源和氮源，二氧化碳作为小球藻光合作用的碳源被同化吸收，导致水体中溶解CO2含量变少，其电离平衡向生成CO2的方向移动，造成水体中的H+大量消耗，pH升高；同时光合作用释放出大量的氧气，增加水体中溶解氧含量，因此，本实验中普通小球藻组DO与pH显著高于对照组。本研究中小球藻在吸收无机氮源时，生物量迅速增长，消耗了水体中的营养盐，限制了后期普通小球藻的增殖[49-51]，表现为藻密度相对稳定。

3.5 普通小球藻在水产养殖产业上的应用

养殖水体添加普通小球藻后，普通小球藻可以迅速同化吸收无机氮离子，合成自身生物量，此时氮的走向为无机氮→小球藻；小球藻被滤食性鱼类或轮虫等浮游动物摄食，氮走向变为小球藻(植物蛋白)→水生动物(动物蛋白)。通过普通小球藻对水体中氮营养盐的吸收利用，可有效防止氮营养盐含量过高引起蓝藻爆发[52-53]。普通小球藻通过光合作用将水体中溶解的CO2作为碳源同化吸收，保持水体弱碱性环境，降低有害细菌繁殖[54]；同时光合作用释放氧气，增加水体溶解氧含量，为养殖动物提供生命保障，也为硝化作用提供必要条件，并有效预防NO3−-N在缺氧环境下被反硝化为NO2−-N，减少对养殖动物的危害[55-57]。光照条件下曝气可显著提高普通小球藻对NO2−-N的去除速率与去除率，同时可促进NH4+-N的去除，因此，利用普通小球藻处理富营养化养殖水体时可配合使用增氧机。适当的藻密度增加有利于提高NH4+-N与NO2−-N去除速率，因此，应对养殖池塘NH4+-N、NO2−-N骤然升高，应选择合理增加藻体密度，而预防养殖池塘NH4+-N、NO2−-N升高，选择较低藻密度处理即可。利用普通小球藻处理工厂化养殖尾水时，通过合理提高光照强度与藻密度，同时给予适当强度的曝气条件，可加快水体中氮盐的去除以改善水质。

4 结论

光照条件下普通小球藻能够有效去除水体中NH4+-N、NO2−-N与NO3−-N，其利用顺序为NH4+-N＞NO3−-N＞NO2−-N。普通小球藻吸收亚硝酸盐过程中，其细胞内亚硝酸盐还原酶活性显著升高。光照增强与藻密度增加对氮盐的去除具有一定的促进作用，光照条件下曝气可显著提高普通小球藻对NO2−-N的去除速率与去除率。基于池塘水体原位生物修复，本研究结果可为绿色健康养殖提供理论支撑。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）