扬子鳄源粘质沙雷氏菌XCYZE株的分离鉴定及其致病性分析

朱 鹏,周永康,姜 纪,李佳佳,易平四,章 松,张雪松,周奎厚,王应超,石 涵,陈洪超,卜孝林,王雅婷,徐前明

粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)属于变形菌门肠杆菌科沙雷氏菌属,是沙雷氏菌属中最常见的一种革兰氏阴性菌,菌体较小、短杆状、周生鞭毛,菌株在28 ℃下培养有玫瑰红样色素产生,菌落有粘性、呈中心颗粒状、有恶臭气味[1]。大量的临床调查结果显示,虽然粘质沙雷氏菌表现出相对较低的毒力,但它会引发中枢神经系统等疾病,例如脑膜炎[2]、尿路感染、肺炎、心内膜炎和其他呼吸道疾病等,尤其是在婴儿和免疫功能低下的患者中。此外,粘质沙雷氏菌也会引起伤口和软组织感染[3-4],发病率及死亡率高达39%～50%[5]。粘质沙雷氏菌具有侵袭性,对许多常用抗菌药具有耐药性,现已成为医院感染的重要条件性致病菌,近年来临床分离率及耐药性都有增加的趋势[6]。该菌除了感染人,还可以感染多种动物如白蚁[7]、山羊[8]、水貂[9]、牦牛[10]、中华鲎[11]、草金鱼[12]、牙鲆[13]等。

扬子鳄是中国特有的一种鳄类动物,为国家一级保护动物,也是世界上濒危物种之一,主要分布在长江中下游流域。由于生态环境的破坏,扬子鳄种群数量急剧下降,近年来围绕着扬子鳄的生存环境、饲养方法、种群繁殖、人工孵化等方面报道较多,但对扬子鳄的细菌性疾病报道还很空缺。顾永熙等[14]报道,上海野生动物园在扬子鳄越冬末期,发现3条死亡鳄鱼、1条病重鳄鱼,通过对其解剖及分离培养,结果分离出3株沙雷氏菌,通过动物实验,证实了该菌具有致病性,推测沙雷氏菌是此次鳄鱼死亡的可能原因。唐名艳[15]通过对扬子鳄血液学及生化指标检测及卵源细菌的分离鉴定,发现鳄鱼胚胎期便有多种细菌感染。

2022年9月下旬,安徽省宣城市扬子鳄繁殖研究中心出现1条死亡幼鳄,幼鳄生前临床表现为精神萎靡不振、食欲下降、四肢无力、活动减少、行动缓慢、头部左右倾斜、眼神黯淡无光、腹部稍肿胀。剖检见肝脏显著肿大,伴有严重出血、胆囊肿大、肾脏明显水肿、肺脏有多处脓性结节和坏死灶,坏死灶中央有脓汁和干酪样物,脑组织有炎性渗出物。取脑组织病料分离培养,获得1株分离菌,经鉴定为粘质沙雷氏菌,可为临床防治该病提供一定借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 主要用品 ExTaq酶、dNTP、蛋白酶K、DNA DL 2000 Marker购自Takara公司;Blood DNA &Tissue kit购自QIAGEN公司;标准革兰氏染色液购自上海源叶生物科技有限公司;普通肉汤培养基、LB液体培养基、血琼脂平板由本实验室提供;生理生化反应管、药敏片购自杭州微生物试剂有限公司;SPF昆明鼠购自安徽医科大学实验动物中心,本实验已通过安徽农业大学实验动物伦理审查委员会批准,编号为AHAUB2022014。

1.2 菌株来源 1株疑似粘质沙雷氏菌分离菌由安徽省宣城市扬子鳄繁殖研究中心的1条死亡幼鳄脑组织病料中分离培养获得。

1.3 菌株的分离培养及形态观察 用接种环从幼鳄的脑内坏死灶中挑取炎性渗出物病料,接种于血琼脂平板,置于37 ℃恒温培养箱培养24 h,挑取疑似沙雷氏菌的菌落接种于普通肉汤培养基于28 ℃继续培养18 h,观察菌落特征。挑取单个特征性菌落,按常规革兰氏染色法染色,镜检观察细菌形态。

1.4 分离菌株的生理生化试验 将分离并纯化的典型单个菌落接种于普通琼脂培养基,28 ℃培养18 h;在无菌条件下挑取培养的单菌落接种于各种生化鉴定管中,置于28 ℃恒温培养箱中培养,观察反应变化,试验结果参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行比对。

1.5 分离菌株的16SrDNA基因序列的测定 取纯化后的细菌培养液提取细菌DNA,细菌通用引物上下游序列分别为27-F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492-R: 5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,选择细菌通用引物及DNA模板进行16SrDNA基因序列PCR扩增,PCR产物经1%琼脂糖核酸凝胶电泳检测后将PCR产物送至南京擎科生物科技有限公司进行测序。测序结果用BLAST进行比对,利用MEGA-X软件构建系统进化树,进行同源性分析。

1.6 致病性试验 选购5～6周龄的昆明鼠进行动物试验。将分离菌进行小鼠致病性试验,分为实验组和对照组,每组5只小鼠。实验组小鼠腹腔注射分离菌菌液0.2 mL(浓度:2×108CFU/mL),对照组小鼠腹腔注射0.2 mL普通肉汤培养基,将小鼠隔离饲养,每8 h观察1次,记录临床表现。

1.7 药物敏感性试验 按常规法用药敏片对分离菌做药敏试验。选用的药敏片有丁胺卡那、恩诺沙星、青霉素、阿莫西林、庆大霉素、氧氟沙星和头孢噻肟共7种常用抗菌药物。

2 结 果

2.1 细菌的菌落形态及特征 培养结果显示,该菌株表面隆起、光滑湿润、边缘整齐,为灰白色中等大小的菌落,菌落中央有红色素(图1)。由镜检结果可以看出菌株为革兰氏阴性菌,短杆状、大小均一,多为单个存在。见图2。

图1 沙雷氏菌XCYZE株的纯培养菌落形态Fig.1 Morphology of pure cultured colonies of Serratia XCYZE strain

图2 XCYZE菌株的革兰氏染色结果 (1 000×) Fig.2 Gram stain results of Serratia XCYZE strain (1 000×)

2.2 分离菌株的生理生化试验 分离菌株XCYZE的生理生化特征如表1所示,可产生葡萄糖、甘露醇、乳糖、柠檬酸盐和硫化氢等,对照《伯杰氏细菌鉴定手册》,结果与粘质沙雷氏菌相符。

表1 分离菌株XCYZE的主要生理生化指标检测结果Tab.1 Results of major physiological and biochemical indexes of the isolated Serratia XCYZE strain

2.3 PCR扩增分离菌株16SrDNA序列结果 以分离菌株基因组DNA为模板,利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增,得到的条带长度约为1 500 bp基因片段(图3)。

注:M.DNA分子质量标准;1.XCYZE株的PCR扩增产物;2.空白对照。图3 16S rDNA鉴定结果Fig.3 Identification results of 16S rDNA from the ioslated

2.4 目的菌株16SrDNA序列遗传进化树分析结果 测序结果见图4,测序完成后, 将目的菌株16SrDNA序列在NCBI中进行BLAST检索,结果显示与Serratiamarcescensstrain GRD 1(GenBank登录号:JN806401.1)等粘质沙雷氏菌的基因同源性达99.10%,同时用MEGA-X软件构建系统进化树(图5),将本试验从扬子鳄幼鳄中分离得到的菌株命名为XCYZE,由进化树分析得知XCYZE株与粘质沙雷氏菌GRD1株的亲缘关系较近,与已报道的粘质沙雷氏菌GRD1株(JN806401.1)在同一分支上(图5),结合细菌形态学、生理生化结果,综合鉴定分离菌株XCYZE为粘质沙雷氏菌,因为GRD1株分离自医院的废水,且与人源的粘质沙雷氏菌有一定的关系。

图4 目的菌株测序结果Fig.4 Sequencing results of the target strain

图5 分离菌株XCYZE的16S rDNA系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA of the isolated Serratia strain XCYZE

2.4 致病性分析 实验组和对照组小鼠分别腹腔注射0.2 mL的分离菌菌液和肉汤培养基后,观察临床表现:8 h后,实验组小鼠开始出现精神亢奋、局促不安、乱窜现象。对照组小鼠精神状态良好;16 h后,实验组小鼠被毛粗乱、食欲减少,精神沉郁。对照组小鼠精神状态和采食量均正常;36 h后,实验组小鼠全部死亡,对照组小鼠2周后健康状态依然良好,未见任何异常。剖检死亡小鼠,可见腹腔大量积液、肠道黏连水肿、肝脏显著肿大、脾脏出血(图6)。将肝、肺切面触片并革兰氏染色,腹腔积液接种于肉汤培养基中进一步培养,结果表明,死亡小鼠体内分离菌确为与接种菌株相同的细菌。

注:A、B为攻毒小鼠腹腔解剖图;C、D为攻毒小鼠肝脏图;E、F为攻毒小鼠脾脏图。图6 小鼠感染沙雷氏菌XCYZE株的主要病理变化Fig.6 Main pathological changes of mice after infected with Serratia XCYZE strain

2.5 药物敏感性分析结果 参照CLSI标准分析:粘质沙雷氏菌XCYZE株对恩诺沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、头孢噻肟高敏;对庆大霉素中敏;对青霉素、阿莫西林耐药。见图7。

图7 XCYZE株沙雷氏菌的药敏试验结果Fig.7 Results of drug susceptibility testing of Serratia XCYZE strain

3 讨 论

目前,关于沙雷氏菌的报道是极其有限的,人们对该菌的认知仅停留在一般生物学特性上。粘质沙雷氏菌最初被认为是无害细菌,但随着关于其致病性报道的增多,粘质沙雷氏菌已被重新定义为重要的条件性致病菌[16]。在我国水产养殖领域,粘质沙雷氏菌也多作为无害细菌被报道,如从养殖废水中分离后作为处理高浊度废水的细菌[17],从鳜鱼肠道分离后作为产生灵红菌素的细菌[18]。但在扬子鳄这类濒危珍稀爬行动物中鲜有报道,关于该病原体是否对爬行动物具有较强的致病力仍是未知的,有待于进一步探讨。

本研究从1起表现脑膜脑炎的扬子鳄中成功分离培养出1株粘质沙雷氏菌,通过一系列细菌学鉴定、系统进化树分析得知该菌株与已报道的粘质沙雷氏菌(JN806401.1)GRD1株同属一支,且亲缘关系较近,确定该菌株即为粘质沙雷氏菌,因为所分离的细菌与GRD1株接近,可能也存在感染人的风险。在致病性分析方面,利用所分离的粘质沙雷氏菌接种SPF昆明鼠,在36 h后全部死亡,死亡率达到100%,且对肝脏、肺脏和脾脏造成严重损伤,腹腔大量积液、肠道黏连水肿、肝脏显著肿大伴有出血特征、肺脏严重出血、脾脏肿大出血;并从感染死亡小鼠肝脏再次分离到致病性沙雷氏菌,从而证实此株粘质沙雷氏菌XCYZE确为导致幼鳄死亡的高致病性病原菌。

粘质沙雷氏菌易于存活,易形成生物膜,对环境和抗生素有较强的抵抗力,对多种常用抗菌药具有耐药性[6],有研究表明,医院分离株较环境分离株耐药性更强[19]。本研究测定了扬子鳄源粘质沙雷氏菌对7种抗生素的敏感性,结果显示该菌对青霉素、阿莫西林等临床常用抗生素产生耐药,对恩诺沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、头孢噻肟等高度敏感,不同来源粘质沙雷氏菌对不同药物的敏感性差异,也间接表明了环境因素对菌株耐药存在一定的影响[20],这为今后的扬子鳄养殖管理、治疗提供参考。同时,粘质沙雷氏菌作为一种有较高致病性的人兽共患病原菌,理应受到相关部门更多重视。

利益冲突：无