基于HIF-1α-VEGF-EPO信号通路探究电针干预大脑中动脉栓塞大鼠脑血管新生的机制

王 玉,刘 芳,姚晓雯,高云云,宋宗胜,唐 巍

(1.安庆师范大学体育学院体育发展研究中心,安徽 安庆 246133;2.安庆医药高等专科学校,安徽 安庆 246052;3.合肥市第一人民医院,安徽 合肥 230061;4.界首市人民医院,安徽 阜阳 236501;5.含山县中医院,徽 马鞍山 238101;6.安徽中医药大学针灸推拿学院,安徽 合肥 230012)

脑卒中是中国成年人死亡和致残排名第一的疾病[1]。缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是脑卒中的主要类型。近年来,IS的发病率持续增高,复发率及死亡率仍处于较高水平[2]。研究[3]表明,缺血半暗带区微血管系统的重建,可为神经元损伤修复、突触重建创造良好微环境,促进神经再生,血管新生是其重要步骤。因此,如何精确调控内源性血管新生,发挥最佳血管效应,是当前研究的重要方向。研究[4]发现,IS后,脑部缺血低氧环境可诱导低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α高表达,转录激活下游血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等表达,参与血管新生,保护受损神经元。本课题组前期研究[5-8]发现,电针“百会”“水沟”“足三里”“曲池”等穴位具有双向良性调节作用,能多途径、多环节、多靶点调控相关通路的蛋白和基因表达,发挥保护神经血管单元的作用。本研究从血管新生角度,观察电针疗法对大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠脑缺血半暗带区皮质HIF-1α、VEGF、EPO表达的影响,进一步探讨电针治疗IS的作用机制,以期为电针治疗IS提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 健康SPF级3月龄雄性SD大鼠108只,体质量280～320 g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,生产许可证号为SCXK(鲁)2019-0003。适应性饲养于IVC-Ⅱ智能型独立通风系统笼具中1周,室温20～26 ℃,湿度45%～55%,自由摄食饮水。术前12 h禁食不禁水。实验遵循《关于善待实验动物的指导性意见》,并获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准(伦理批准号:AHUCM-rats-2020006)。

1.2 试剂 苏木素染色液(批号 718034)、伊红染色液(醇溶性,批号 718011):珠海Baso;无水乙醇(批号 20180410)、异丙醇(批号 20171030)、二甲苯(批号 20180310):上海苏懿化学试剂有限公司;山羊抗小鼠IgG(批号 140193)、山羊抗兔IgG(批号 202700514):北京Zsbio;HIF-1α(批号 GR80143-2):英国Abcam;VEGF(批号 A1717):美国Santa Cruz;EPO(批号 AI12183222):北京Bioss。

1.3 仪器 生物组织包埋机(型号 YB-7LF):湖北省亚光医用电子技术有限公司;普通PCR仪(型号 K960):杭州晶格科学仪器有限公司;超微量分光光度计(型号 OD1000+):南京五义科技有限公司;华佗牌电子针疗仪(型号 SDZ-Ⅳ):苏州医疗用品有限公司。

2 方法

2.1 模型制备及分组 按随机数字表法选取36只大鼠为假手术组,其余大鼠参照Zea Longa法[9]制备MCAO模型。大鼠称质量后,采用1%戊巴比妥钠生理盐水溶液(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,待大鼠呼吸平稳、角膜反射消失后,将其四肢仰卧位固定于鼠板,于颈部进行无菌操作,然后于正中偏右0.5～1 cm处作一纵行切口,钝性分离皮下组织,暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。电凝笔电离颈外动脉,轻拉其游离端,使之与颈内动脉成180°。动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉,在颈外动脉游离端作一小切口,将直径0.28 mm鱼线经切口插入,松开颈内动脉处动脉夹,当鱼线插入18～20 mm微感阻力时停止插线,打结固定,松开颈总动脉处动脉夹后缝合。肌肉注射0.5 mL青霉素预防术后感染。假手术组仅分离颈总动脉,不结扎,不插鱼线。术后4 h进行改良神经功能损害评分(modified neurological severity scores,mNSS)[10],2～18分视为模型复制成功。将模型复制成功的72只大鼠随机分为模型组、电针组,每组根据治疗时间分为3、7、14 d 共3个亚组,每个亚组12只。后续实验中采用差额补充法,保证每个亚组12只大鼠。

2.2 干预方法 电针组术后4 h进行首次电针治疗。参照大鼠穴位图谱[11]和《实验针灸学》[12],选取“百会”(向前斜刺2 mm)、“水沟”(沿鼻中隔方向斜刺3 mm)和左侧“后三里”(即“足三里”,直刺7 mm)、“曲池”穴(直刺4 mm)针刺。将电子针疗仪接于毫针针柄,“百会”“水沟”为一组,左侧“后三里”“曲池”一组,近心端穴接正极,远心端穴接负极。疏密波,频率5～100 Hz,输出电流1～2 mA,刺激时间20 min,强度以针体微抖动、腧穴局部微颤、大鼠能耐受为度,每日1次,治疗3、7、14 d。假手术组、模型组仅同等抓取固定,不干预治疗。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 mNSS评估大鼠神经功能缺损情况 采用单盲法,由同一未知实验内容、熟练掌握mNSS方法的实验人员对各组大鼠术后4 h,3、7、14 d的运动、感觉、反射和异常活动4个方面行为进行评分,最高18分,最低0分。评分越高表示神经损伤越严重。

2.3.2 多普勒超声测定大鼠局部脑血流量(regional cerebral blood flow,rCBF) 于插线后5 min及干预3、7、14 d后测量大鼠rCBF。麻醉大鼠、剃除右颞侧大脑中动脉区域被毛,将牙科钻定位于冠状缝向颅骨后部4 mm,距矢状缝两侧3 mm处磨薄颅骨,钻出半径约1 mm的圆孔,暴露脑组织。将激光多普勒探头用生物速凝胶固定于硬脑膜,调试仪器检测和记录大鼠rCBF。

2.3.3 苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察大鼠脑组织病理学改变 每个亚组随机抽取3只大鼠,麻醉后固定,开腹暴露心脏,将灌注针经左心室插入升主动脉,并在右心耳处开一小口,用0.9%氯化钠注射液快速冲灌,至右心耳流出液无血色,改用4%多聚甲醛固定液灌注至大鼠颈部和前肢僵硬时停止。灌注后断头取脑,制成厚约4 μm石蜡切片,常规HE染色,光学显微镜下观察脑组织病理学变化。

2.3.4 免疫组织化学法检测缺血半暗带区皮质CD34阳性细胞数 将CD34一抗、二抗加入上述石蜡切片,孵育、显色和封片。光学显微镜下以细胞内棕黄色颗粒沉着为CD34阳性表达。随机选取5个视野的平均计数为缺血半暗带区皮质CD34阳性细胞数。

2.3.5 Western blot法检测大鼠脑缺血半暗带区皮质HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达水平 每个亚组随机取3只大鼠断头取脑,分离右侧缺血半暗带区脑组织。取100 mg组织加入RIPA细胞裂解液1 mL(内含1 mmol PMSF)裂解,进行电泳、转膜、封闭等;按试剂盒步骤孵育一抗、二抗;使用ECL发光试剂盒检测蛋白,运用X胶片曝光显像,利用凝胶成像系统照相,采用灰度值进行统计分析。

2.3.6 RT-PCR检测大鼠脑缺血半暗带区皮质HIF-1α、VEGF、EPO mRNA的表达 每个亚组随机取6只大鼠麻醉取脑。取50～100 mg脑组织剪碎,提取组织中总RNA,用逆转录试剂盒进行反转录,使RNA转换成cDNA后进行PCR反应,反应结束后得到HIF-1α、VEGF、EPO基因CT值,以2-ΔΔCT表示目的基因的相对表达量。引物序列及产物长度见表1。

表1 目的基因RT-PCR的引物序列

3 结果

3.1 3组大鼠mNSS比较 假手术组大鼠无神经功能缺损体征,随着时间的延长,模型组、电针组大鼠mNSS均显著减少(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠术后4 h,3、7、14 d,mNSS均显著增加(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠术后7、14 d评分显著减少(P<0.05)。见图1。

注:A.术后4 h;A′.插线后5 min;B.术后3 d;C.术后7 d;D.术后14 d;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与术后4 h比较,aP<0.05;与插线后5 min比较,a′P<0.05;与术后3 d比较,bP<0.05;与术后7 d比较,cP<0.05

3.2 3组大鼠缺血半暗带区皮质rCBF比较 假手术组大鼠rCBF正常平稳,随着时间的延长,模型组、电针组大鼠rCBF均显著增加(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠插线后5 min,术后3、7、14 d rCBF均显著减少(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠术后7、14 d rCBF均显著增加(P<0.05)。见图1。

3.3 3组大鼠缺血半暗带区皮质组织形态比较 假手术组大鼠术后各时点皮质神经元形态、结构正常,无水肿,无炎症细胞浸润。模型组、电针组术后3 d缺血半暗带区皮质细胞结构疏松、呈网状,排列紊乱稀疏,大量神经元坏死,间质水肿明显,术后7、14 d神经元形态、结构、排列等情况均有所改善,且电针组改善效果更佳。见图2。

图2 3组大鼠缺血半暗带区皮质组织

3.4 3组大鼠缺血半暗带区皮质CD34阳性细胞数比较 随着时间的延长,假手术组、模型组大鼠CD34阳性细胞数变化差异无统计学意义(P>0.05),电针组大鼠CD34阳性细胞数显著增加(P<0.05),且整体呈上升趋势。与假手术组比较,模型组大鼠CD34阳性细胞数显著增加(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠CD34阳性细胞数显著增加(P<0.05)。见图3、图4。

注:红色箭头所指棕黄色颗粒或条索状物为CD34阳性细胞

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与术后3 d比较,bP<0.05;B.术后3 d;C.术后7 d;D.术后14 d

3.5 3组大鼠缺血半暗带区皮质HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达水平比较 随着时间的延长,假手术组大鼠HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达水平变化差异均无统计学意义(P>0.05),模型组、电针组HIF-1α、VEGF蛋白表达水平术后14 d显著升高(P<0.05),EPO蛋白表达水平术后3 d最高(P<0.05)。与假手术组比较,模型组HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。见图5。

注:B.术后3 d;C.术后7 d;D.术后14 d;Ⅰ.假手术组;Ⅱ.模型组;Ⅲ.电针组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与术后3 d比较,bP<0.05;与术后7 d比较,cP<0.05

3.6 3组大鼠缺血半暗带区皮质HIF-1α、VEGF、EPO mRNA表达水平比较 随着时间的延长,假手术组大鼠HIF-1α、VEGF、EPO mRNA表达水平变化差异均无统计学意义(P>0.05),模型组大鼠VEGF、EPO mRNA表达水平呈上升趋势,均在术后14 d显著升高(P<0.05),电针组大鼠HIF-1α、EPO mRNA表达水平呈上升趋势,均在术后14 d显著升高(P<0.05)。与假手术组比较,模型组HIF-1α、VEGF、EPO mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组HIF-1α、VEGF、EPO mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。见图6。

注:B.术后3 d;C.术后7 d;D.术后14 d;与假手术组比较,∗P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与术后3 d比较,bP<0.05;与术后7 d比较,cP<0.05

4 讨论

血管新生可能是治疗缺血性疾病的新靶点[13-14]。IS发生后,血管新生是脑血管系统重塑的重要方式,新生的血管能及早改善和恢复缺血半暗带区的血液供应,修复濒临死亡的神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞,形成新的侧支血管,为神经重塑、脑功能重组提供重要物质基础。因此,刺激血管内皮细胞增殖、分化、迁移和微血管形成是治疗脑缺血的新途径。

电针疗法将中医学治疗手段和现代电刺激治疗相结合,治疗脑卒中疗效显著[15]。IS可归属于中医学“中风”范畴,属本虚标实之证,以风火相煽、痰湿雍盛、气血逆乱为标,肝肾不足、气血衰少为本,实由虚致,病位在脑。基于数据挖掘技术分析[16]和穴位配伍规律,本研究选取“百会”“水沟”“足三里”“曲池”。“百会”“水沟”系督脉穴位,有益脑滋髓、开窍启闭之效,临床疗效显著。“治痿独取阳明”,“足三里”“曲池”为手阳明经和足阳明经的合穴,针刺阳明经合穴可疏通经络,补脏腑原气,扶机体正气,促偏瘫肢体恢复。本研究结果显示,针刺上述穴位能有效改善大鼠神经功能缺损状况。

HIF-1α广泛存在于哺乳动物细胞中,是低氧状态下调控血管新生和稳定细胞内环境和氧平衡的核心调控因子,是介导低氧信号的转导中枢[17]。VEGF、EPO是HIF-1α下游重要的靶基因。常氧条件下,HIF-1α呈低表达,当机体缺血低氧后,HIF-1α和HIF-1β结合形成HIF-1后再次进入细胞核,HIF-1与细胞核中的低氧反应元件结合,作用于VEGF编码基因和VEGFR编码基因的结合位点,增加VEGF mRNA的表达,使VEGF蛋白合成增加,同时激活EPO,参与调控血管生成,保护神经元免受低氧或缺血诱导的损伤[18-19]。VEGF可能通过激活下游VEGFR-PI3K-AKT-eNOS通路,刺激血管内皮细胞增殖、分化、迁移而促血管新生;VEGF有舒张血管作用,可增加脑血流量[20]。脑组织在低氧条件下产生的EPO,对血管内皮细胞有促有丝分裂和正趋化作用,维持血管完整性,促血管生成,且生成潜力与VEGF相当[21]。VEGF和EPO之间具有相互促进、循环激活趋势。本研究发现,脑缺血低氧环境会诱导内源性HIF-1α高表达,上调VEGF、EPO表达水平,启动血管新生机制,发挥一定程度的防御作用,但机体自我修复能力有限,尚不足以代偿原有血液供应。电针疗法可进一步上调HIF-1α、VEGF、EPO表达,促进内皮细胞增殖和迁移,从而加速血管新生,提高rCBF,改善大鼠神经功能缺损状况,且存在时间蓄积效应。

CD34可作为血管新生标志物,CD34阳性细胞数量可代表内皮祖细胞数量,用于观察脑缺血后血管的新生情况[22]。内皮祖细胞在正常成年人外周血中含量极低,具有高度增殖性,具有启动新血管形成和靶向修复受损血管的双重作用[23]。本研究发现,电针疗法能促进CD34阳性细胞数量增加,可能对缺血损伤区域内皮细胞和神经元生长恢复发挥保护作用,为神经血管单元提供良好的微环境。

综上所述,电针“百会”“水沟”“足三里”“曲池”能激活HIF-1α-VEGF-EPO通路蛋白和基因表达,增加CD34阳性细胞数量,介导内皮细胞血管新生,从而提高MCAO大鼠rCBF,改善脑组织结构和功能,且治疗效果具有时间累积效应。随着低氧环境的改善、脑血流的恢复,电针疗法为何能使HIF-1α持续增高?是否脑缺血后HIF的诱导不完全是低氧本身的结果?是否有其他通路调控HIF-1α的表达?这些将是下一步研究的方向。