藏药翁布对溃疡性结肠炎的作用机制研究

李新蕊,陈海娟,2*,高禹涵,徐 丽

1青海师范大学生命科学学院 青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室;2高原科学与可持续发展研究院,西宁810008

翁布为传统藏药,其来源为柽柳科水柏枝属(Myricaria)多种植物的嫩叶[1],广泛分布于西藏、青海、云南等地。现代研究表明,翁布的主要化学成分为黄酮类和多酚类化合物[1],药用部位为嫩枝,青绿色,其性平,味涩微苦,治黄水病、内腔毒热、发散透疹,用于瘟疫、血热、中毒热证,麻疹不透及咽喉肿痛等症[2]。“久痢”的基本病机是脾虚湿热蕴结,气血不和,而“血热”是溃疡结肠炎活动期的重要致病因素[3]。现代药理学研究表明翁布还具有抑菌、抗炎镇痛、抗风湿、抗疲劳和抗氧化等作用[4]。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因尚未完全清楚的结肠慢性炎症疾病,病变局限于大肠黏膜及黏膜下层[5],主要症状为腹痛、腹泻、黏液脓血便等[6],且病情易复发、迁延难愈[7]。免疫抑制剂、皮质类固醇激素和氨基水杨酸钠制剂是目前治疗UC的主要手段,短期治疗效果明显,但存在不良反应大、不能维持等问题[8]。翁布对UC是否有治疗作用,尚不明确。本研究拟通过UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术、网络药理学、分子对接和动物实验验证,探究藏药翁布治疗UC的作用及机制,为翁布的合理开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性C57BL-6小鼠,40只,清洁级,体重(20 ± 2)g,购于西安交通大学医学实验动物中心(动物生产许可证号:SCXK(陕)-2017003),实验前适应性饲养7 d,自由摄食、饮水,室内温度18～24 ℃,相对湿度40%～70%,每日12 h光照维持,昼夜循环。实验过程中动物的处置均符合实验动物伦理学规范,实验程序符合青海师范大学实验动物伦理委员会的批准(编号20230310)。

1.2 实验药物和试剂

翁布采自2022年7月青海省海东市民和县古鄯镇,经青海师范大学生命科学学院尚军副教授鉴定为水柏枝(Myricariagermanica)嫩枝叶。美沙拉嗪胶囊(批号:H20020211,黑龙江天宏药业有限公司):葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)(批号:0216011090,美国MP公司,);多聚甲醛(PFA)固定液(批号:G1101-500ML,武汉塞维尔生物科技有限公司);TNF-α、IL-6试剂盒(批号:J24082、J24111,武汉吉立德生物科技有限公司);羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na)(批号:S851013,上海弘顺生物科技有限公司);其他分析纯均购自山东禹王化学试剂厂。

1.3 实验仪器

高通量组织破碎仪(Tissuelyser-48,上海净信实业发展有限公司);台式快速离心浓缩干燥器(ZLS-1,湖南赫西仪器装备有限公司);氮气吹扫仪(Reacti-thermo)、超高效液相色谱(UHPLC)、质谱仪(Q Exactive)(赛默飞世尔科技有限公司)。

1.4 动物实验

1.4.1 DSS模型制备和给药方法

取干燥的翁布嫩枝叶2 kg,粉碎,用10倍量的75%乙醇加热冷凝回流提取3次,每次120 min,合并三次提取液,浓缩减压干燥得翁布乙醇提取物浸膏。给药时,将浸膏用0.5% CMC-Na配成混悬液[9]。Bao等[10]用乙醇回流提取翁布嫩枝叶,用生理盐水配成含提取物0.14 g/mL(相当于生药量0.864 g/kg)的溶液,探究藏药翁布提取物对SD大鼠FCA诱导性关节炎的试验研究。参照此给药剂量换算小鼠给药高、低翁布提取物混悬液:0.06、0.24 mg/L;阳性药美沙拉嗪胶囊:0.3 g/kg。

将40只小鼠随机分为空白对照组(negative control,NC)、DSS模型组(DSS model,Mod)、翁布高(M.germanicahigh dose,MG-H)、低剂量组M.germanicalow dose,MG-L)和阳性药物美沙拉嗪(5-aminosalicylic acid,5-ASA)组。实验期间,空白组小鼠给予蒸馏水,其余各组采用自由饮用3% DSS溶液(每天8时定时更换添加新的饲喂蒸馏水及DSS溶液),均连续饲喂7 d,建立UC小鼠模型。实验期间每天测量小鼠体重、观察粪便性状,肛门是否便血,并进行DAI评分。于造模第3 d和7 d各组随机各取1只小鼠,颈椎脱臼处死,测量小鼠结肠长度和观察充血程度,并结合体重变化和便血程度确认是否造模成功。从造模第1 d开始,每天定时上午9时对小鼠进行1次灌胃,连续15 d。

1.4.2 血清、结肠样本的采集和检测

最后一次给药后,禁食不禁水24 h,进行眼眶取血,静置,以3 000 r/min转速离心10 min,收集上清液,测定小鼠血清中白介素6和肿瘤坏死因子-α的含量,具体方法按照ELISA试剂盒的说明书进行检测。实验结束后,各组小鼠脱颈处死,解剖取结肠,测量并记录结肠长度;肉眼观察结肠表面有无充血、溃疡等变化;取出的肠段组织,生理盐水(预冷)清洗内容物,切取约1 cm变化较为明显的肠段并用滤纸吸干水分,使用组织固定液固定,再进行石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色,观察结肠组织的病理变化情况。免疫组织化学检验的切片60 ℃烤箱过夜,脱蜡水化,抗原修复,血清封闭,DAB显色脱水,透明中性树胶封片,光镜下观察结果。

1.4.3 RT-qPCR法检测UC小鼠结肠组织TNF-α和IL-6mRNA表达

按“1.4.2”项下方法取各组取小鼠结肠黏膜组织研磨匀浆,在小鼠结肠黏膜组织样本中加入Trizol,经氯仿、异丙醇体系提取组织总mRNA,经逆转录合成对应的cDNA,完成RT-PCR的检测。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR反应引物序列

1.5 网络药理学分析

1.5.1 UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS获取翁布化学成分

1.5.1.1 样品制备

将干燥的翁布嫩枝叶研磨粉碎,过100目筛,得翁布粉末样品,低温保存。样本在4 ℃环境下解冻后,称取量适量样本(0.1～200 mg),分别加入0.1 mL水(预冷),涡旋1 min,加入400 μL预冷甲醇乙腈溶液(1∶1,V/V),涡旋1 min,低温超声0.5 h,2次,-20 ℃放置1 h沉淀蛋白,12 000 r/min,4 ℃离心20 min,取上清真空干燥复溶于200 μL 30%乙腈,涡旋,14 000 g,4 ℃离心0.25 h,取上清上机检测。

1.5.1.2 液相色谱参数

色谱柱:Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相:A相为0.1%甲酸-水溶液,B相为0.1%甲酸-乙腈-异丙醇;流速0.3 mL/min;柱温40 ℃;进样量2 μL;洗脱梯度:0.0～2.0 min A/B(90∶10,V/V),6.0～15.0 min A/B(40∶60,V/V),15.1～17.0 min水/乙腈(90∶10,V/V);将样品置于4 ℃自动进样器进行自动进样分析(随机顺序连续分析),为监测和评价系统的稳定性和实验数据的可靠性,实验时将QC∶样品穿插入样本序列中。

1.5.1.3 QE质谱条件

采用美国Thermo公司Q exactive高分辨质谱检测系统进行样本一级、二级谱图的采集。电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)条件如下:鞘气40 arb;辅助气10 arb;离子喷雾电压3 000 V/-2 800 V;温度350 ℃;离子传输管温度320 ℃。扫描模式为Full-scan MS2模式;扫描方式为正离子/负离子,一级扫描范围:70～1 050 Da,二级扫描200～2 000,一级分辨率70 000,二级17 500。

1.5.2 翁布主要活性成分靶蛋白的预测

将UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS得到的化学成分在TCMSP(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)平台进行筛选,筛选口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30,类药性(drug-likeness,DL)>0.18,利用PubChem数据库查找活性成分的Canonical SMILES表达式,导入SwissTargetPreddiction数据库和TargetNet数据库进行筛选,预测翁布各成分对应靶蛋白,合并23个活性成分在两个数据库的筛选结果。

1.5.3 溃疡性结肠炎相关基因靶点收集

以“ulcerative colitis”为关键词,在GeneCards数据库中检索UC的潜在靶点。通过Excel计算,以Score>1.07进行筛选,获取最终UC相关基因靶点。

1.5.4 翁布治疗UC潜在靶点预测

在Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)网站输入翁布靶点和UC靶点,得到二者相交靶点图,相交部分即翁布治疗UC的潜在靶点。

1.5.5 翁布活性成分-UC靶点网络图的构建

运用Cytoscape3.9.0构建“翁布-活性成分-UC”靶点网络图,进行有效成分及靶点的拓扑数据分析(TDA)分析,包括度值(degree)、中介中心度(betweenness centeality,BC)和接近中心度(closeness centeality,CC),并根据TDA分析参数判断翁布治疗UC核心靶点及其发挥药效的主要活性成分。

1.5.6 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络的构建和关键靶点的筛选

将1.5.5所得翁布治疗UC核心基因靶点导入STRING数据库构建蛋白互作网络,并将相互作用信息导入Cytoscape3.9.0软件中,进行拓扑数据分析(TDA),计算出各节点的度值、BC和CC,选择TDA分析参数均大于中位数的靶蛋白,获得关键靶点。

1.5.7 关键靶蛋白GO富集分析和KEGG通路分析

将上述“1.5.6”所得的14个关键靶蛋白导入DAVID数据库,对其进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,获得翁布治疗UC的潜在通路。通过微生信作图平台得到GO富集分析的气泡图和KEGG通路分析图。

1.5.8 翁布核心成分与溃疡性结肠炎作用核心靶蛋白的分子对接验证

将“翁布-活性成分-UC”疾病靶点网络图中TDA分析参数排名前5的活性成分与PPI网络TDA分析得到的核心靶蛋白进行分子对接。UniProt数据库和PDB数据库下载核心蛋白3D结构的pdb文件;从TCMSP数据库获取翁布活性成分2D结构的mol2文件。运用AutoDockTools软件首先进行核心蛋白去水、加氢,选为受体,然后对活性成分小分子进行加氢处理,将其选为配基。然后准备Autogrid和AutoDock并运行,运行完毕后进行半柔性对接(semi-flexible docking),将对接结果运用OpenBabel和PyMOL软件进行转换和绘图处理,得到翁布主要有效成分治疗UC的证据支持。

2 结果

2.1 网络药理学分析

2.1.1 翁布治疗UC主要活性成分及靶点筛选

翁布供试品溶液按上述色谱和质谱条件进UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS分析,结合正、负离子模式下总离子流图(见图1),根据所测精确分子量,将一级质谱数据与数据库化合物的分子式对比,对化合物进行初步鉴定,从翁布中共鉴定出171种化合物,经TCMSP数据库进行筛选,获得翁布有效成分23个(见表2)。通过SwissTarget Prediction数据库对翁布的23个活性成分的作用靶点进行预测,共获得285个活性成分靶点。

图1 翁布药材总离子流图

表2 翁布活性成分和靶点数

2.1.2 翁布治疗UC的核心靶点筛选及PPI网络的构建

从GeneCards数据库筛选出UC靶点2 415个。将以上285个活性成分靶点与2 415个疾病相关靶点取交集,获得翁布治疗UC的潜在作用靶点111个(见图2)。将上述共有靶点构建“翁布-活性成分-UC”网络图,如图3所示,翁布治疗UC的核心成分为蟛蜞菊内酯、去甲蟛蜞菊内酯、大黄酸、鞣花酸和异鼠李素,最主要靶点为TNF、ABCB1、RELA等。将筛选出的潜在靶点输入到String数据库,构建PPI蛋白相互作用网络图,如图4所示,TNF、EGFR和CASP3等基因位于PPI网络图的核心位置,在PPI网络中发挥关键调控作用。

图2 溃疡性结肠炎与翁布交集靶点韦恩图

图3 翁布“活性成分-作用靶点”网络

图4 蛋白-蛋白互作网络

2.1.3 翁布治疗溃疡性结肠炎潜在靶点生物功能与通路的富集分析

GO功能富集分析包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(cell component,CC)三个模块。如图5所示,BP显示靶基因主要集中在一氧化氮合酶调控过程、蛋白磷酸化调控、细胞凋亡过程、平滑肌细胞增殖调控和氧化应激反应等;CC主要与核染色质、蛋白质复合物、细胞质等有关;MF主要与相同蛋白质结合、蛋白质复合物、细胞质等有关。KEGG通路富集分析显示(如图6所示),翁布治疗UC的药理作用通路包括癌症通路、TNF信号转导、MAPK信号转导通路和雌激素信号通路等。

图5 GO功能富集分析

图6 KEGG通路富集分析

2.1.4 翁布核心活性成分与溃疡性结肠炎共同作用靶蛋白的分子对接验证

为进一步验证翁布治疗溃疡性结肠炎的分子机制,将翁布治疗溃疡性结肠炎的核心成分与靶点进行分子对接,初步验证两者之间的结合活性,结果见表3。配基与蛋白受体之间的结合能越低,两者之间亲和能力越好,构想也更稳定[11,12]。对接结果显示,大黄酸、去甲蟛蜞菊内酯、蟛蜞菊内酯和鞣花酸等化合物与关键作用靶点TNF、CASP3、EGFR、PTGS2和HSP90AA1的结合能均小于-5.10 kcal/mol,说明两者之间具有较好的结合活性,且大黄酸与TNF,大黄酸、去甲蟛蜞菊内酯和蟛蜞菊内酯与PTGS2之间的结合能均小于-7.23 kcal/mol,显示出强烈的结合活性,利用PyMOL软件进行可视化分析(见图7),观察可视化图发现所述配基化合物均能很稳定地包裹在受体蛋白的活性口袋中。Rheic acid通过氨基酸残基ALA-109、GLY-224、VAL-226与TNF形成5条氢键,通过氨基酸残基CYS-32、TYR-116、CYS-26、HIS-24、LYS-454、GLU-451与PTGS2形成7条氢键。去甲蟛蜞菊内酯与PTGS2通过氨基酸残基ASN-28、GLN-26、ARG-29、CYS-26、LYS-454、CYS-32、HIS-24、GLU-451形成9条氢键,并且所述配基化合物均能很稳定地包裹在受体蛋白的活性口袋中。

图7 分子对接示意图

表3 翁布核心成分与核心靶蛋白结合能

2.2 体内实验验证

2.2.1 翁布提取物对UC小鼠一般状态的影响

空白对照组小鼠毛发、大便、饮食均正常,精神状态良好,体重自然增加;与空白对照组相比,模型组小鼠精神状态倦怠,身体蜷缩,少动,毛发无光泽,出现不同程度的便血、腹泻或肛门血染,如图8所示,体重在造模期间逐渐减少,停止造模后缓慢增加;与模型组相比,翁布各给药组和5-ASA组在造模第1～5 d体重增加缓慢,在停止造模后,随着治疗的推进,体重逐渐回升。模型组小鼠DAI评分较空白组增加;与模型组相比,5-ASA组和翁布各剂量组小鼠DAI评分降低。

图8 翁布对UC小鼠体重和DAI评分的影响

2.2.2 翁布对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理损伤的影响

空白对照组小鼠腺体排列整齐,黏膜结构完整,未见炎性细胞浸润;与空白对照组相比,模型组小鼠腺体排列紊乱,间隙增大,上皮脱落,炎性细胞浸润明显。与模型组相比,各给药组小鼠黏膜结构,腺体排列和炎性细胞浸润程度等均有所改善(见图9)。

图9 翁布对UC小鼠结肠组织病理变化的影响

2.2.3 翁布对UC小鼠血清中TNF-α和IL-6水平的影响

与空白对照组相比,模型组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.001);与模型组相比,翁布高、低剂量组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织TNF-α和IL-6水平显著降低(P<0.01)(见图10)。

图10 翁布对UC小鼠血清中TNF-α和IL-6含量的影响

2.2.4 翁布对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织TNF-α和IL-6表达的影响

与空白对照组相比,模型组小鼠结肠组织中TNF-α和IL-6阳性染色表达显著增加;与模型组相比,翁布高、中、低剂量组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织紧密连接相关蛋白TNF-α和IL-6阳性染色表达显著增加(见图11)。

图11 翁布对UC小鼠结肠组织TNF-α和IL-6表达的影响

2.2.5 翁布对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响

与空白对照组相比,模型组小鼠结肠组织TNF-α和IL-6 mRNA表达显著升高(P<0.001);与模型组相比,翁布高、低剂量组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织TNF-α和IL-6 mRNA表达显著降低(P<0.05)(见图12)。

图12 翁布对UC小鼠结肠组织TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响

3 讨论与结论

本研究运用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术分析出翁布171个成分,通过TCMSP平台筛选出翁布活性成分23个。根据“翁布-活性成分-UC”网络图可知,匹配靶点最多的前5个成分为蟛蜞菊内酯、去甲蟛蜞菊内酯、大黄酸、异鼠李素、鞣花酸。He等[13]的研究表明鞣花酸具有抗氧化、抗炎等药理作用。Zheng等[14]研究发现鞣花酸通过抑制MAPK/IκB-α/NF-κB/COX等通路,显著减少TNF-α、IL-1β、NO释放,进而产生改善UC的作用。大黄酸具有抗肿瘤、抑菌和抗炎等活性[15,16],且研究表明[16]大黄酸可通过抑制JAK2等靶蛋白阻碍炎症信号传递,减少炎症因子的释放,缓解UC免疫功能异常引起的炎症反应[17]。异鼠李素(isorhamnetin,ISO)是一种广泛存在于多种植物的天然小分子黄酮类化合物,具有抗炎、抗病毒等多种生物学功能[18]。ISO可通过抑制MPO的活性、阻碍促炎介质(TNF-α、IL-2、IL-6)的释放、下调NF-κB信号通路来发挥抗炎、治疗炎症性肠炎的作用[19]。蟛蜞菊内酯能抑制NLRP3炎症小体的激活和细胞焦亡,从而在体内发挥抗炎作用[20]。

通过网络药理学技术筛选得到翁布作用靶点285个,溃疡性结肠炎疾病靶点2 415个,交集后得到111个治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点,通过构建“翁布-活性成分-UC”网络,揭示了翁布治疗溃疡性结肠炎的分子机制;通过蛋白互作网络预测翁布治疗溃疡性结肠炎的关键靶点,PPI网络分析发现翁布可能通过调控TNF、CASP3、EGFR、PTGS2和HSP90AA1等靶蛋白,发挥治疗溃疡性结肠炎的作用,而这些基因直接或间接参与细胞炎症、凋亡、氧化应激等过程。TNF-α是治疗溃疡性结肠炎的关键靶点,有研究表明溃疡性结肠炎患者的粪便样本和结肠黏膜活检标本中发现TNF-α水平升高,抗TNF-α单抗可通过阻断其生物活性以达到抗炎的目的,抗TNF-α单克隆抗体药物在治疗溃疡性结肠炎方面具有较好疗效[21]。凋亡蛋白酶(caspases)参与细胞凋亡,胱天蛋白酶3(CASP3)细胞凋亡过程中起重要作用[22]。溃疡性结肠炎的发生与细胞凋亡密切相关,动物研究表明,溃疡性结肠炎模型组肠黏膜中CASP3含量均显著升高,且经有效药物处理后,其表达水平下调,结肠细胞凋亡率明显下降[23]。前列素内过氧化物合成酶(PTGS2)蛋白参与多条炎症反应信号通路,抑制该蛋白能够减少炎症介质的产生[24]。EGFR信号通路作为人体中的关键信号通路,介导细胞的凋亡和增殖,与结肠黏膜损伤的发生有关,因此,干预EGFR信号通路为治疗UC提供了可能。有研究显示溃疡性结肠炎肠黏膜受损会影响EGFR表达,进而减少对结肠黏膜的保护及修复作用,并发现EGFR水平与UC复发密切相关[25]。HSP90AA1与炎症密切相关,可调节细胞的增殖和凋亡,抑制HSP90AA1能诱导自噬从而改善溃疡性结肠炎[26]。

由此推测,翁布可能通过调控上述5个靶蛋白抗炎、抗氧化、减少细胞凋亡,发挥治疗UC作用。分子对接结果也显示,翁布与以上5个核心基因具有良好的结合活性。

KEGG结果显示,翁布治疗溃疡性结肠炎的主要通路有细胞免疫研究的核心通路T细胞受体信号通路、MAPK信号通路以及TNF-α信号通路等。白介素6、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β是炎症反应中常见的三种炎症因子[27]。TNF-α和IL-1β是急性UC早期的重要促炎因子。促炎因子抑制效应T细胞凋亡发挥持续促炎作用等,从而参与UC的发生发展。有研究表明[28]可通过TNF-α/NF-κB信号通路改善肺、肠组织的病理损伤,达到肺、肠同治的作用。丝裂原活化蛋白激酶信号通路包括ERK以及p38 MAPK等信号通路,其能够参与调控炎症反应、氧化应激、细胞分化与凋亡等多种生理病理过程[29],MAPK信号转导与UC的炎症反应密切相关。

TNF-α是机体受到有害刺激所释放的第一个细胞因子,IL-1β可由TNF-α诱导产生。IL-1β增加可以与TNF-α协同作用,共同刺激IL-6的产生[30]。因此,本研究采用网络药理学和分子对接技术预测翁布对溃疡性结肠炎的潜在作用治疗靶点及信号通路,并通过自由饮用DSS复制溃疡性结肠炎症小鼠模型进行药效学评价,翁布可以改善DSS诱导的UC小鼠的结肠长度和结肠黏膜损伤,降低结肠和血清中TNF-α和IL-6的含量,缓解溃疡性结肠炎症反应。

综上所述,本研究通过网络药理学方法对翁布治疗UC的作用机制进行系统性分析,并利用分子对接技术初步验证其作用靶点,同时通过C57BL-6小鼠体内实验检验翁布治疗UC作用的药效。研究结果初步表明翁布可通过“多靶点、多通路”治疗UC,可缓解DSS诱导的炎症反应,而其机制尚不清晰。后续工作将对其进行研究,以期为翁布治疗溃疡性结肠炎的作用机制提供参考。