畜禽粪肥中抗生素残留对土壤微生物及抗性基因的影响分析研究进展*

牛明芬 谢田宾 王颜红 周 强 王镜然

(1.沈阳建筑大学市政与环境工程学院,辽宁 沈阳 110168;2.中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁 沈阳 110016)

近年来,在绿色有机农产品生产种植过程中,有机肥的施加是提高农产品产量和品质的一项有效措施。研究发现,采用有机肥替代部分化肥施用,可在满足作物生长需求的同时,获得产量增长和品质提升的效果[1]。王明文等[2-3]研究表明,有机肥替代40%化肥会使大蒜增产15.93%,使其维生素C(Vc)、可溶性糖和可溶性蛋白分别提高24.41%、31.77%和72.55%;有机肥替代20%化肥会使黄瓜增产59.54%,使其Vc、可溶性糖和粗蛋白分别提高49.46%、16.23%和44.44%。由此看来,有机肥已成为促进绿色农业高质量发展的重要手段。

我国使用的有机肥大多来自于养殖场的畜禽粪便[4],而随着现代规模化养殖业的发展,抗生素的滥用会导致畜禽粪便中残留有各种抗生素。已有报道指出,大部分抗生素不能被动物机体完全吸收,大约有40%～90%的抗生素以原形或代谢物形式随粪便排出体外[5]。直接施用畜禽粪肥可导致大量抗生素进入土壤,随着抗生素进入土壤时间的增长,土壤中的微生物对抗生素的耐药性会增强,进而产生大量抗药菌[6]。土壤中抗药菌的不断增多,对土壤中其他微生物菌群的群落结构或功能造成影响[7],同时显著提升土壤微生物菌群中抗生素抗性基因(ARGs)的丰度[8]。施用未腐熟的有机肥,长时间以来土壤中环境的变化会导致种植出的农产品抗性下降,病虫害增多[9]。张明[10]和马鸣超等[11]均研究表明,未腐熟的有机肥若不加处理直接施入农田会引起病虫害的产生、提高作物发病率。因此,对当前农田土壤中抗生素残留现状进行研究分析就显得尤为重要。

1 农田土壤抗生素残留水平

有机肥施用是保障我国粮食生产的重要环节之一,但施用处理不当的有机粪肥,长期累积对农田土壤和农产品带来的抗生素残留问题越来越严重。通过对查阅的文献进行汇总,农田土壤抗生素残留水平如表1所示。

表1 农田土壤抗生素的残留水平1)Table 1 The residual level of antibiotics in farmland soil

随着有机绿色农业的持续发展和关注,有机粪肥的施用量越来越大,国内外农田土壤中抗生素的残留水平也不断升高。农田土壤中四环素类抗生素残留最为严重。AN等[12]研究表明,沈阳地区某农田土壤中土霉素和金霉素分别高达1 398.47、1 590.16 μg/kg,四环素也接近1 000.00 μg/kg。尹春艳等[13]研究发现,山东某典型设施蔬菜基地土壤中四环素类抗生素的检出率为100%,平均为274.00 μg/kg,喹诺酮类抗生素检出率为85%,平均为73.05 μg/kg。张慧敏等[14]对浙北地区某农田表层土壤检测发现,土霉素、四环素和金霉素的检出率分别为93%、88%和93%,平均残留量分别为350.00、1 071.00、119.00 μg/kg,分别是未施畜禽粪肥农田的39、13、12倍,可以看出施畜禽粪肥会带来农田土壤抗生素残留。朱秀辉等[28]在广州北郊蔬菜基地土壤上四环素类抗生素的检出率在90%以上,通过层次分析法表明畜禽粪肥是土壤中四环素类抗生素的主要来源。由此可见,我国不同地区的农田土壤抗生素残留水平不同,大多地区的抗生素含量超出了国际兽药协会(VICH)提出的土壤抗生素生态毒害效应的触发值(100.00 μg/kg)[29],表明土壤中普遍存在抗生素残留。

不仅我国农田土壤受到抗生素残留困扰,国外亦如此。JACOBSEN等[21]发现丹麦地区的四环素类抗生素残留量高达14 400.00 μg/kg。HO等[22]在马来西亚某农田土壤中发现,强力霉素和恩诺沙星最高分别达728.00、378.00 μg/kg,氟甲喹最高达到了1 331.00 μg/kg,即使在施肥7个月后,检测到的恩诺沙星也达到20.00 μg/kg。CARBALLO等[23]在奥地利某施用粪肥1～2个月后的农田土壤中发现,恩诺沙星和环丙沙星分别达到370.00、450.00 μg/kg。HAMSCHER等[24]在德国某施用粪肥后的农田表层土(0～10 cm)中发现,四环素平均为86.20 μg/kg,而在10～20 cm的土层中,增加到198.70 μg/kg。可以看出,随着畜禽粪肥施用时间的增长,土壤对抗生素累积的程度越大,随着土壤深度的增加,残留的抗生素含量也会增加。因此施用畜禽粪肥对土壤中抗生素的分布具有明显影响,且国内外的农田土壤抗生素残留情况均不容乐观,对农田土壤环境影响现状进行分析和评估很有必要。

2 农田土壤抗生素残留检测方法

由于施用未经处理的有机肥会对农田土壤造成抗生素残留和累积的影响,造成土壤抗生素污染随之引发一系列的问题[30]。成熟有效的农田土壤抗生素检测方法是研究土壤抗生素污染问题的前提。准确检测出农田土壤中抗生素的种类和含量,对于评估当前农田土壤抗生素残留现状、判断抗生素对农田土壤和农产品的影响、防治抗生素污染具有重要意义。目前土壤中抗生素检测的主要方法有传统的生物法、免疫分析法以及理化分析法,理化分析法主要包括毛细管电泳法、液相色谱法和液质联用法[31],不同检测方法比较见表2。

表2 土壤中抗生素检测方法比较Table 2 Comparison of detection methods of antibiotics in soil

土壤中抗生素的残留检测分析起源于1981年,WARMAN等[32]采用生物法发现了用鸡粪施肥的土壤中存在金霉素,当时该方法的回收率较低,仅为22%～28%。后来随着技术的进步,研发出基于碳纳米管的免疫分析新方法,韦薇[33]建立可用于土壤中庆大霉素检测的抑制曲线,测得土壤中庆大霉素在0.198～0.380 ng/g,其检测限和线性范围良好。再后来,出现了毛细管电泳法。左艳丽[34]研究发现,该方法可检测土壤中磺胺间二甲氧基嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺嘧啶分别在≥0.070、≥0.063、≥0.056 mg/kg水平上的残留。李兴华等[35]采用固相萃取前处理,高效毛细管电泳法检出养殖场附近土壤中磺胺嘧啶和磺胺噻唑分别为0.044 3、0.043 5 mg/kg。根据研究发现,农田土壤中残留的抗生素不仅仅以单一的形式存在,而大多是以复合的形式存在[36]。传统的一些方法存在单检测、不全面或无法对大量数据进行准确分析等问题,近年来发展出的一种高效、全面且灵活的手段可以解决这一瓶颈——高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)。通过试验优化不同的提取方法,结果均有良好的回收率和低的检测限[37],[42-43]。胡钰等[38]基于固相萃取—超高效液相色谱—串联质谱技术对6个不同地区的农田土壤中7类共30种抗生素残留进行分析,结果显示,检出的17种抗生素中有12种检出率达100%,总量为73.4～184.0 μg/kg,说明该方法具有高效灵敏等特点。

传统的土壤抗生素生物检测法在过去的一段时间内占主导地位[44],由于其回收率和灵敏度较低等原因逐渐被淘汰。免疫分析法虽然具有良好的检测限和线性范围,但是其准确性和重现性较差[45]。毛细管电泳法具有低检出限、高回收率的特点,但是后来随着高效液相色谱法(HPLC)的出现,也慢慢替代了毛细管电泳法。HPLC可以简单快速地检测出土壤样品中残留的抗生素,具有很强的分离能力,而后发展起来的HPLC-MS可以检测更多种类、更多数量的抗生素,比HPLC具备准确度更高、检测限更低等优点[46],该方法仪器设备成熟,测试结果接受度高,并且还形成了通用的标准方法。这些方法的比较结果显示,无论是灵敏度、还是检测范围,HPLC-MS都具有非常明显的优势。

但是由于土壤环境相对较复杂,分析方法的局限性将会是限制土壤中抗生素残留研究的一个重要原因[39]53。而组学技术是对一类个体系统集合的全景分析技术,它依托高通量的现代化分析仪器,基于色谱、质谱等获取的大量数据或峰图[39]54,通过分析其中的特征抗生素来定性。YANG等[47]使用高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS)对非洲肯尼亚不同地区的农田土壤中抗生素进行检测,采用SPSS软件组学分析出12种抗生素的浓度存在统计学差异,采用单因素方差法分析出不同采样点的抗生素存在组间差异,并且表明肯尼亚农田土壤中主要是四环素和喹诺酮类抗生素污染。

组学分析方法的出现使得对土壤中多种类抗生素的鉴别更加灵敏,大幅度提高了分析效率,为农田土壤中抗生素的检测和残留分析提供方法学基础。抗生素检测方法的研究,对加强农田土壤抗生素污染监控与防治,有着极为重要的意义。对查阅的农田土壤抗生素检测方法文献进行汇总,其应用占比如图1所示。

图1 抗生素检测方法应用占比Fig.1 Application ratio of antibiotic detection methods

3 抗生素对土壤微生物菌群与ARGs的影响

3.1 抗生素残留对土壤中微生物菌群的影响

土壤微生物菌群是土壤生态系统的重要组成部分,是衡量土壤肥力的重要指标,大多数土壤过程都离不开土壤微生物的参与[48]。大量未经处理的畜禽粪便作为肥料直接施用于农田,某些残留的抗生素会被农田土壤吸附并积累[49]1435。土壤中累积的抗生素会抑制其靶标微生物的生长繁殖和代谢活动,选择性地诱杀土著微生物或诱导耐药菌的产生,影响了土壤中微生物菌群多样性;其他未受到抑制的微生物能够获得大量资源而快速繁殖,改变了微生物群落结构和功能[50]21,破坏土壤微生态平衡。

3.1.1 影响土壤微生物的活性

残留的抗生素进入土壤后,由于抗生素本身的作用,能对土壤中微生物产生各种毒性效应,可以直接杀死土壤环境中某些微生物菌群或抑制其活性[51]。有研究表明,当有机肥输入达到阈值水平(9 000 kg/hm2)时,可以改变土壤抵抗力,过度施用肥料会抑制土壤微生物活性[52]。还有研究表明,抑制微生物活性的有效抗生素剂量为0.003～7.350 μg/g,这取决于抗生素种类及其土壤吸附,并且根据分配系数计算,0.200～160.000 ng/g的抗生素显著减少了土壤细菌的数量[53]。

据研究,土壤中抗生素的残留对土壤微生物的呼吸、氨化、硝化以及磷转化作用等均有抑制作用[54]。土壤呼吸作用是衡量土壤微生物总体活性的指标。刘锋等[55]实验表明,磺胺类和甲氧苄啶抗生素对土壤呼吸作用影响较大,而四环素类和大环内酯类抗生素对土壤呼吸作用影响不大。袁德梽[56]实验表明,不同浓度的抗生素残留对土壤呼吸作用表现出的抑制水平不同,抗生素残留浓度越大,抑制水平相对越高。杨基峰等[57]研究发现,磺胺嘧啶、氧四环素和诺氟沙星3种抗生素对土壤呼吸的最大抑制率分别为76.8%、20.7%和21.9%,并且高浓度的抗生素对土壤微生物的硝化作用表现出不同程度的抑制作用。

3.1.2 影响土壤微生物菌群多样性

抗生素进入土壤后会扰乱土壤中微生物菌群的正常秩序[58],长时间以来,土壤中的微生物对抗生素的耐药性增强,进而产生耐药菌[59]。SENGELOV等[60]在长期施用猪粪的农田中发现了大量的耐药菌株：四环素耐药菌每毫升高达8.75×107个,链霉素耐药菌每毫升高达2.3×107～4.6×107个,且猪粪使用量越大,耐药菌株的耐药性越强。随着耐药菌的不断增多,土壤中其他微生物菌群的多样性将下降,从而导致土壤环境受影响。曾悦等[61]的研究表明,氟喹诺酮类和四环素类抗生素在>10 mg/kg时,对土壤中微生物多样性会表现出抑制作用,磺胺类抗生素在≥100 mg/kg后,其抑制作用更加显著。UDDIN等[62]研究表明,水稻土受兽用抗生素污染后可引起细菌多样性降低。张海丰等[63]通过模拟实验论证了土壤受不同浓度磺胺甲恶唑污染后,土壤细菌的多样性显著降低(P<0.05)。抗生素药物的化学结构与细菌生长所需的氨基苯甲酸很相似,可与氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,妨碍二氢叶酸的形成,最终影响细菌核蛋白的合成,从而抑制细菌的生长繁殖[64]。

Chao1和Shannon多样性指数是评价微生物菌群多样性的重要指标,多样性指数越高表明微生物菌群的丰富度和多样性越高。马驿等[65]实验表明,恩诺沙星影响下土壤微生物菌群的丰富度指数和多样性指数显著低于空白对照组,且抗生素浓度越高,丰富度和多样性越小。于晓雯等[66]实验表明,四环素类抗生素随畜禽粪肥进入土壤中改变了土壤微生物菌群的相对丰度,对四环素类抗生素适应能力较强的菌群相对丰度升高,对其较敏感的其他菌群相对丰度下降。由此可见,抗生素的残留会使土壤中微生物的数量下降,土壤微生物菌群的多样性降低。

3.1.3 影响土壤微生物群落结构及功能

土壤微生物对土壤环境的变化非常敏感,通常情况下,土壤中微生物群落组成处于相对稳定的状态。残留抗生素的加入改变了土壤的理化性质,使得土壤中微生物群落组成和功能发生相应的动态改变[67]。张跃华等[68]和汤玮婧等[69]曾在早期的实验中表明,在向土壤中施入抗生素后,细菌和真菌数目随抗生素浓度的增加整体呈减少趋势,放线菌数目整体呈上升趋势。HEUER等[70]实验表明,通过向土壤中施加含不同质量浓度(0、10、100 mg/kg)磺胺嘧啶的猪粪,可导致土壤中细菌群落受到影响,甚至能持续两个月以上。汪勇等[71]在长期施用新鲜鸡粪、新鲜猪粪的土壤中检测到四环素抗性细菌数量比普通土壤高出3～4个数量级,四环素抗性细菌占可培养细菌总数的比例比表施化肥高出37～500倍,抗性细菌丰度的改变使得粪肥处理的土壤和其他处理有显著不同的群落结构;并且他们还发现深层土(10～20 cm)中抗性细菌数量比表层土(0～10 cm)高出2%～6%。

由于抗生素在土壤中有假持久性,土壤中微生物群落的功能也会发生改变。早在2001年,WESTERGAARD等[72]在土培条件下研究了泰乐素对土壤微生物群落功能的影响,结果表明泰乐素抑制了土壤中某些细菌类群的生长功能。王加龙等[73]研究表明,较低浓度的恩诺沙星残留不影响土壤微生物群落功能多样性,而相对较高浓度的恩诺沙星残留则能够降低土壤微生物群落功能多样性。KONG等[74]将从土壤中提取的微生物群落暴露于含有土霉素的生理盐水溶液,发现土壤微生物群落功能多样性随土霉素浓度升高显著降低。

应用宏基因组技术能够解析复杂环境中微生物群落物种组成[75],但是目前该技术主要应用于研究抗生素对水环境微生物群落的影响[76],而对于抗生素胁迫下土壤中微生物群落结构变化鲜有报道。

3.2 抗生素残留对土壤ARGs的影响

3.2.1 畜禽粪肥施用土壤中的ARGs

含有抗生素的畜禽粪肥进入土壤长时间以来,土壤微生物群落构成了选择压力,会导致其产生ARGs[49]1436。虽然EDDTE[77]的研究表明,在未受影响的土壤中,微生物自身拥有丰富多样的抗药性及ARGs(比如MARC等[78]就曾在17个南极土壤样品中发现了177种自然存在的ARGs),但是ARGs被认定为一种新型的环境面源污染物,可以通过基因水平转移作用在微生物之间传播或自我扩增[79],具有难被生物降解的特性。土壤中抗生素残留被认为是加剧ARGs形成与传播的主要因素[80]。土壤微生物群落中ARGs丰度的提高使农田土壤成为了ARGs的一个储存库[81]。研究表明,土壤微生物通过产生抗性基因来适应含抗生素的土壤,即使最后土壤环境中的抗生素污染可以消除,已经形成抗性的微生物和抗性基因仍然会在土壤环境中持续存在,从而会对整个土壤系统造成危害[82]。

抗生素的不规范使用也会诱导动物体内产生ARGs,随畜禽粪便排放后对土壤环境将造成一定的影响[83]。近年来,有许多学者从畜禽粪便中检测出ARGs,如四环素类ARGs：tetA、tetC、tetE、tetG、tetM、tetO、tetQ和tetT;磺胺类ARGs：sul1、sul2和sul3;喹诺酮类ARGs：oqxB、qnrS和qnrD;链霉素类ARGs：strA、strB;氨基糖苷类ARGs：aadA;大环内酯类ARGs：ermB、ermF等[84]3435,[85]6938,[86-87]。这表明畜禽粪便中存在丰富多样的抗性基因,多种抗性机制并存已成为一种普遍现象。不同类ARGs在不同粪便中赋存不同,总浓度为鸡粪>猪粪>牛粪,且喹诺酮类和磺胺类ARGs的分布最为普遍丰富[85]6939。而土壤中ARGs的相对丰度按类别依次为四环素类>磺胺类>氯霉素类>氨基糖苷类[88]。

3.2.2 对ARGs种类和丰度的影响

畜禽粪肥的长期施用,抗生素的加入引起土壤理化环境波动,会通过富集或抑制土壤中的相关菌属直接影响ARGs丰度,并改变移动元件(MGEs)的丰度来对ARGs产生间接作用[50]14,从而影响土壤原有ARGs的组成和丰度。HAN等[89]认为施用猪粪和鸡粪通过影响土壤的理化性质,增加土壤中细菌的丰度,进而影响土壤中ARGs和MGEs的丰度;研究表明,46.3%的ARGs变异可以由细菌群落(27.6%)、MGEs(8.9%)、土壤理化性质(4.2%)、细菌群落+ MGEs(1.5%)、细菌群落+土壤理化性质(1.9%)、MGEs+土壤理化性质(1.4%)和细菌群落+土壤理化性质+MGEs(0.8%)解释。

目前已有多项研究显示,施用集约化养殖的畜禽粪肥会引起农田土壤中的ARGs种类增加,丰度和检出率提高[90]。ARGs从粪便到土壤的水平转移会导致土壤中长期存在ARGs[91],CHEN等[92]在长期施用鸡粪的农田土壤中发现,130个不同亚型的ARGs丰度(102～103)均显著高于无鸡粪添加对照组(10-2～10),通过Shannon和Simpson指数计算出鸡粪处理显著增加了ARGs的多样性。TANG等[93]在长期施用粪肥的水稻土中发现,土壤中抗生素残留质量浓度达8 750 μg/kg,不同地区的ARGs丰度均上升1～2个数量级不等(见图2),可以看出ARGs的丰度与施用畜禽粪肥的关系呈显著正相关。FANG等[94]在对施用鸡粪的蔬菜大棚土壤中ARGs和人类病原菌(HPB)的研究发现,长期施用粪肥的温室土壤中抗生素、ARGs、HPB种类和HPB中ARGs含量更高,分别为22类、32种、46种和156.2～5 001.4 μg/kg。一旦这些具有抗生素耐药性的人类致病菌(如假单胞菌属)进入食物链,可能会造成感染风险。并且还有研究表明,施肥3年的土壤中的ARGs丰度最高,比对照土壤高出近3×105倍;施肥年限大于10年的土壤中磺胺类ARGs丰度最高,约为对照土壤的105倍;施肥土壤中耐药菌率是对照土壤的5倍[95]。

注：数据来自文献[93]。图2 4个地区不施肥与施肥土壤中ARGs丰度对比Fig.2 ARGs abundance in fertilized and unfertilized soils in four regions

随着科技的发展,高通量测序、生物信息学和组学分析技术的发展为多尺度、多层次研究ARGs的发生、转移和扩散途径及机制提供了科学手段。例如,ZHU等[84]3438采用高通量荧光定量聚合酶链式反应(PCR)的方法对我国3个商业养猪场的粪便及施加粪肥的土壤进行检测,共发现5大类共149种ARGs,其中有63种ARGs的丰度显著高于对照组192～28 000倍。FORSBERG等[96]对18个农田土壤中18种抗生素进行了功能宏基因组选择,发现了2 895个新的ARGs。SU等[97]利用功能基因组学的方法从土壤样品中筛选出多种ARGs,同已知ARGs相比,发现氨基酸水平上只有2%的ARGs相似性在90%以上,而67%以上的ARGs相似性低于60%。这表明环境中还有很多尚未被认识的ARGs,可能会有更多的ARGs在土壤微生物间传播转移,致使更多土壤微生物获得抗性,从而引起更多抗药细菌的出现,对土壤环境造成一定的潜在风险。

3.2.3 ARGs的消减

为了有效扼制ARGs传播到土壤,众所周知,高温堆肥处理是减少畜禽粪便中ARGs的一种有效手段。利用堆肥过程产生的高温,可有效去除耐药微生物和耐药质粒,并降解粪便中残留的抗生素,减少ARGs的水平转移[98]。研究表明,堆肥10 d后,ARGs总量下降了4～6个数量级,ARGs的绝对丰度随着堆肥过程的进行而逐渐降低,抗性基因aadA、sul2、mcr-1、oqxB的消减率分别为89.39%、97.99%、99.89%、99.81%,多重耐药大肠杆菌16S rRNA基因消减速率为0.128 d-1,半消减期为5.41 d,耐药基因消减规律符合一级动力学方程[99]。也有研究表明,在堆肥中加入化学抑制剂(如吲哚、胺类、石灰氮等)可增强ARGs的去除效果,从而降低ARGs的丰度[100]。但是,目前采用的仍是传统的堆肥法,处理过程中存在多种调控因素,如堆肥的温度、高温持续时间、pH、含水量、生物量以及供氧量等,因此还需要进一步探讨新型ARGs消减技术。

未经处理的畜禽粪肥被认为是土壤ARGs的主要来源,施用集约化养殖的畜禽粪肥导致土壤中抗生素残留扰乱了土壤微生物菌群,造成土壤生态环境紊乱,致使土壤产生更多ARGs。相比抗生素带来的危害,ARGs的出现对农业产地环境和农产品的影响更加严峻,所以对ARGs源头的控制和削减就尤为重要。

综上所述,土壤中微生物菌群对土壤中ARGs的赋存具有一定的影响,而ARGs功能的行使需要以微生物为载体,二者之间的变化可以直观地表明土壤中抗生素残留的状况,可以作为评估农田土壤抗生素残留状况的一种手段。

4 结论与展望

施用未经处理的有机粪肥可导致农田土壤中抗生素残留风险,现代的检测技术和组学理念能更高效、科学地发现和解释土壤抗生素影响水平。抗生素残留可导致土壤微生物菌群中抗性细菌数量增加,土壤中ARGs丰度增加。

目前畜禽粪肥中抗生素残留对土壤微生物影响的研究已经有很多,大多是基于对微生物群落结构和功能变化的现象描述,缺乏更为深入的机理及影响因素研究。而且抗生素长期存在于土壤环境中必然诱导抗性基因的产生,目前对抗性基因的传播扩散以及其可能造成的生态风险尚缺乏系统研究。希望未来可以对以下几个方面加强研究：

(1) 鉴于抗生素滥用带来的生态风险,亟待加强兽药抗生素的使用规范、监管,同时加强集约化养殖场粪尿的无害化处理技术研究,保障有机粪肥安全施用。

(2) 畜禽粪肥是土壤环境中抗生素的重要来源之一,未来还需进一步探索其复杂组分对抗生素影响土壤微生物作用的机理,以充分了解和掌握残留抗生素的畜禽粪肥在土地利用时的生态风险。

(3) 深入了解土壤微生物菌群和ARGs之间具体的作用机理及关系,利用微生物变化达到管理控制ARGs的传播扩散,从而为管控抗生素的负面环境影响提供科技支撑。