一种极性依赖性双光子溶酶体荧光探针的合成及性能

王碧玉, 刘成露, 徐奥琼, 冯可心, 李龙春

(安徽农业大学 理学院,安徽 合肥 230036)

具有双光子吸收性能的有机荧光探针在光限幅、三维微加工、光学传感和生物显微成像等领域有着广泛的应用。在生物学领域,有机荧光探针具有极高的空间分辨率和较大的组织穿透深度[1-5]。然而,用于荧光显微成像的双光子材料需要有较大的有效双光子吸收截面、较高的生物相容性和优秀的生物体内底物选择性[6-9]。因此,设计合成具有较大有效双光子吸收截面、具有良好生物相容性和特定底物选择性的有机荧光探针是深入拓展有机双光子吸收材料在生物学领域应用的关键[10-13]。

极性是微环境中的一种重要参数,一些特定的无机或有机反应均依赖于极性的参与[14]。在生物系统里,尤其在细胞层面上,极性决定了大多数蛋白质和酶的联系并影响了各种细胞器膜组分的通透性。极性的稳定是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件,而极性的异常变化通常会导致一些疾病的产生[15-17]。

近年来,荧光探针成为了一种非常流行的生物传感和生物成像技术,在生物医学领域中发挥着十分重要的作用。萘酰亚胺及其衍生物作为一种性能良好的荧光团,具有荧光量子产率高、斯托克斯(Stokes)位移大、光学性质稳定和对溶液pH不敏感等优点[18-19]。特别地是,萘酰亚胺及其衍生物还具有结构上易于修饰的特点[20-22]。

因此,本文以4-溴-1,8-萘二甲酸酐为原料,通过脱水酰胺化反应引入N,N-二甲基基团,4号位上通过Sonogashira偶联反应引入对甲氧基苯乙炔,从而增加萘酰亚胺荧光团的共轭体系,构建成以甲氧基为电子给体(Donor)、酰胺基为电子受体(Acceptor)且具有D-π-A结构的荧光探针分子Lyso-LCL(图1),该探针具有分子内电荷转移(Intermolecular Charge Transfer, ICT)机制[23-24]。同时研究在不同极性溶剂中探针Lyso-LCL的紫外吸收光谱、荧光发射光谱和双光子荧光光谱,并对它的有效双光子吸收截面进行了计算。在此基础上,进一步对探针Lyso-LCL进行了3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(氮蓝四唑,MTT)[25]和溶酶体的靶向功能分析。

图1 Lyso-LCL的合成路线Figure 1 Synthesis route of Lyso-LCL

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Angilent 600 MHz型核磁共振仪[CD3Cl为溶剂,四甲基硅烷(Tetramethysilane, TMS)为内标]; TU-1901型双光束紫外可见分光光度计; Hitachi FL-7000型荧光光谱仪;Coherent Mira 900 F型钛宝石激光器; Waters Q-TOF Premier型质谱仪; OLYMPUS FV 1000型激光共聚焦显微镜。

4-溴-1,8-萘二甲酸酐、2-(对二甲基氨基苯基)乙胺、无水乙醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、三乙胺、碘化亚铜、三苯基膦二氯化钯、对甲氧基苯乙炔、无水硫酸钠、氢氧化钠、浓盐酸和二氯甲烷均为分析纯试剂,阿拉丁试剂有限公司;1,4-二氧六环(1,4-Dioxane)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)、四氢呋喃(Tetrahydrofuran, THF)、正己醇(n-Hexanol)、甲基异丙基甲酮(Methylisopropylketon, MIPK)、二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、乙腈(Acetonitrile)和甲醇(Methanol)均为色谱纯试剂,北京安耐吉试剂公司。

1.2 化合物1的合成

称取4-溴-1,8-萘二甲酸酐2.75 g(10.00 mmol)置于100 mL洁净干燥的圆底烧瓶中。加入50 mL无水乙醇搅拌溶解完全,再加入2-(对二甲基氨基苯基)乙胺1.80 g(11.00 mmol),在80 ℃下回流反应。待有固体析出后,继续反应一段时间,有大量固体析出时停止反应,冷却至室温,旋去乙醇,真空干燥,最终得到无色固体化合物13.58 g(8.50 mmol),产率85%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.66(d,J=7.3 Hz, 1H), 8.57(d,J=8.5 Hz, 1H), 8.42(d,J=7.8 Hz, 1H), 8.04(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.85(t,J=7.8 Hz, 1H), 7.24(d,J=8.3 Hz, 2H), 6.72(d,J=8.3 Hz, 2H), 4.36～4.31(m, 2H), 2.93(s, 2H), 2.91(d,J=7.1 Hz, 6H);13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 163.44, 149.43, 133.18, 131.94, 131.10, 130.65, 130.15, 129.58, 129.03, 128.04, 126.70, 123.20, 122.33, 113.02, 42.24, 40.81, 33.24; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C22H19BrN2O2{[M+H]+} 423.0708, found 423.0690。

1.3 探针Lyso-LCL的合成

在氮气保护条件下,向150 mL洁净干燥的Schlenk瓶中加入化合物11.26 g(3.00 mmol)、对甲氧基苯乙炔0.48 g(3.60 mmol)、三苯基膦二氯化钯21.00 mg(0.03 mmol)、碘化亚铜17 mg(0.09 mmol)、三乙胺0.36 g(3.60 mmol)和30 mL NMP。 80 ℃条件下磁力搅拌反应10 h。待反应结束后,冷却至室温,并转移至分液漏斗中,用二氯甲烷萃取,旋干溶剂,加入柱层析硅胶制样,用柱色谱分离(洗脱剂:石油醚 ∶乙酸乙酯=3 ∶1,V∶V)得到淡黄色固体Lyso-LCL0.85 g,产率60%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.73(d,J=8.0 Hz, 1H), 8.64(d,J=7.0 Hz, 1H), 8.55(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.92(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.83(t,J=7.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=8.7 Hz, 2H), 7.27(s, 2H), 6.95(d,J=8.7 Hz, 2H), 6.75(s, 2H), 4.37～4.32(m, 2H), 3.87(s, 3H), 2.95(s, 2H), 2.93(s, 6H);13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ:163.89, 163.62, 160.56, 133.48, 132.42, 131.51, 130.36, 129.65, 128.11, 127.25, 123.01, 121.75, 114.31, 99.53, 85.35, 55.37, 42.17, 33.31, 29.65; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C31H26N2O3{[M+H]+}475.2021, found 475.2006。

1.4 性能测试

Lyso-LCL母液用色谱纯DMSO配制,浓度为1 mM(1×10-3mol·L-1),测试样品的浓度为5 μM(5×10-6mol·L-1)。所用样品池为1.0 cm×1.0 cm石英比色皿。荧光发射光谱的狭缝宽度为2.5 nm×2.5 nm,测试电压为400 V,测试温度为室温。双光子荧光光谱的测试以760 nm的飞秒激光为激发光源,入射能量为0.5 W,测试浓度为1 mM(1×10-3mol·L-1)。

2 结果与讨论

2.1 探针Lyso-LCL在不同溶剂中的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱

首先,本研究测试了Lyso-LCL在不同溶剂(1,4-二氧六环、乙酸乙酯、四氢呋喃、正己醇、甲基异丙基甲酮、二甲亚砜、乙腈、甲醇和水)中的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱,结果如表1和图2所示。从图2(a)可知,在不同溶剂中,当溶剂的极性从1,4-二氧六环(极性很小,δ:≈0.0205)依次增大到水(极性很大,δ:≈0.3212)时,Lyso-LCL的最大紫外吸收峰在390～400 nm之间,只发生了微小的变化。然而,从图2(b)可以看出,Lyso-LCL荧光发射峰随溶剂极性的增大而发生红移,其中,在极性较弱的1,4-二氧六环(468 nm)、乙酸乙酯(487 nm)等溶剂中,发射较强的蓝色荧光;而在中等强度极性的甲基异丙基甲酮(518 nm)、二甲亚砜(525 nm)等溶剂的中,发射较强的绿色荧光;在强极性溶剂水(550 nm)中,发射较弱的黄绿色荧光。强极性溶剂的荧光发射峰相对于弱极性溶剂发生了约82 nm的红移。无论是强极性溶剂还是弱极性溶剂中,都有较大的Stokes红移,最大红移为149 nm。同时,Lyso-LCL在弱极性的溶剂中具有很强的荧光发射峰,而在强极性的溶剂甲醇和水中,其荧光发射峰相对强度较弱,例如1,4-二氧六环的荧光强度是水的72倍。上述结果表明,探针Lyso-LCL体现出良好的溶剂极性响应能力,主要原因是以甲氧基为电子给体(Donor),酰胺基为电子受体(Acceptor),形成了具有D-π-A的电子结构。当包裹在Lyso-LCL探针分子周围的溶剂分子的偶极矩发生变化时,由于分子各部分对偶极矩变化的敏感程度不同,分子骨架会发生轻微的扭转,分子的供吸电子能力发生变化,在分子内电荷转移ICT机理的作用下,Lyso-LCL分子在极性溶剂中能量大大降低,导致荧光光谱红移,同时非辐射过程增强,荧光强度也大大下降。这些数据表明探针Lyso-LCL对不同溶剂的极性十分敏感,能够对不同溶剂极性的变化做出响应,可以作为一种检测极性的探针。

表1 Lyso-LCL在不同溶剂中的光谱性质*Table 1 Spectral properties of Lyso-LCL in various solvents

λ/nm

2.2 Lyso-LCL在四氢呋喃-水混合溶剂极性体系中的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱

为了进一步证明Lyso-LCL溶剂极性响应能力,本文选取了2种互溶溶剂,一种为相对弱极性溶剂THF,另一种为强极性溶剂水,并测试了Lyso-LCL在不同含水量的THF-H2O混合溶剂的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱。如图3和表2所示,随着水体积分数逐渐增大,紫外吸收峰没有发生明显变化,基本稳定在400 nm。极性的变化对Lyso-LCL的紫外吸收光谱基本没有造成影响。然而,随着混合溶剂中水含量的增加,混合溶剂的极性随之增加,Lyso-LCL的最大荧光发射峰逐渐发生了红移,含水量为10%(δ:≈0.2559)时,荧光发射峰为506 nm,而含水量为80%(δ:≈0.3131)时,荧光发射峰为541 nm,红移了35 nm。此外,随着含水量的增加,Lyso-LCL荧光发射强度也逐渐减弱,并在红移的过程中荧光强度下降了约27倍(图4)。这些数据表明Lyso-LCL的荧光强度与极性变化的线性关系良好,且能够规律地对溶剂极性变化作出响应,能够作为一个良好的极性荧光探针。

表2 Lyso-LCL在四氢呋喃-水混合溶剂中的的光谱性质Table 2 Spectral properties of Lyso-LCL in THF-H2O mixed solvents

λ/nm

ΔF图4 Lyso-LCL在不同体积分数的四氢呋喃-水混合溶液中的最大荧光强度与溶剂极性参数δ: 的线性关系Figure 4 Linearity of Imax versus the solvent parameter δ: of Lyso-LCL in THF-H2O mixed solvents with different volume percents

2.3 Lyso-LCL的双光子验证及有效双光子吸收截面

Lyso-LCL的有效双光子吸收截面采用参比法测定[26],采用1.0 mM的荧光素NaOH水溶液进行实验,其中NaOH浓度以1 nM作为参比。荧光素的荧光量子产率为0.95,其不同波长双光子吸收截面值可查文献[27]。根据计算,得到Lyso-LCL在激发光波长740～940 nm之间。入射能量为0.5 W 时,四氢呋喃溶液中的有效双光子吸收截面值如图5(a)所示,Lyso-LCL在820 nm飞秒激光的激发下,具有最大的有效双光子吸收截面126 GM。为了进一步验证Lyso-LCL在四氢呋喃溶液中产生的荧光来自样品的双光子吸收效应,本文将波长设定为800 nm,通过改变入射激光的能量(0.3～0.8 W),测试了四氢呋喃为溶剂的Lyso-LCL在不同入射光强度下的双光子荧光光谱,结果发现,荧光输出能量(Iout)和输入能量(Iin)之间有很好的平方关系,如图5(b)所示(线性斜率为1.99,R2=0.9967),且符合双光子性质的规律,说明Lyso-LCL具有双光子吸收性质,并可以发射双光子诱导荧光。

λ/nm

2.4 Lyso-LCL的细胞毒性测试分析

细胞毒性是化合物应用于活体细胞或组织时必须研究的基本生物学性能。因此需要对Lyso-LCL细胞毒性进行初步研究。实验采用MTT测试法,选用的细胞为Hela细胞,结果如图6所示。由图6可以看出,Hela细胞在加入Lyso-LCL培养24 h后,随着化合物浓度的增加,细胞存活率逐渐降低。当浓度为5 μM时,细胞存活率可以达到96%。然而当浓度为20 μM且培养24 h后,细胞存活率仍然可以达到85%。这些数据表明Lyso-LCL具有较低的细胞生物毒性,因此,可以进行包括细胞成像等生物学方面的应用研究。

Concentration/μM图6 Lyso-LCL的细胞毒性MTT测试Figure 6 MTT assay of cells cytotoxicity of Lyso-LCL

2.5 Lyso-LCL的细胞溶酶体靶向共定位实验分析

在细胞培养皿中加入5 μM探针Lyso-LCL和0.5 μM的溶酶体染料Lyso Tracker Red,并置于37 ℃恒温且含有5% CO2和95%空气的无菌培养箱中培养45 min。接着,用灭菌后pH=7.4的10 mM PBS缓冲溶液清洗3次。最后进行溶酶体靶向共定位双光子荧光显微成像实验。本实验使用的成像仪器是蔡司710共聚焦荧光显微镜,双光子光源采用的是锁膜钛蓝宝石激光光源,获得的Hela细胞溶酶体靶向共定位照片如图7所示。

图7(a)为Lyso-LCL的荧光发射通道1(530±20 nm),双光子激发波长为820 nm。图7(b)为溶酶体商染(Lyso Tracker Red)的荧光发射通道2(600±10 nm),激发波长为559 nm;图7(c)为明场,分别为通道1和通道2的叠加图以及通道1、通道2和明场的叠加图。从图7(f)的荧光共聚焦成像可以探针Lyso-LCL与Lyso Tracker Red在Hela细胞里的共定位情况,共定位系数为0.93。这些结果说明探针Lyso-LCL与溶酶体商染Lyso Tracker Red在活细胞中溶酶体上的重叠效果很好,探针Lyso-CL可以很好地靶向于细胞溶酶体。

本文以4-溴-1,8-萘二甲酸酐为原料,构建具有D-π-A结构的荧光探针分子Lyso-LCL,该探针具有分子内电荷转移机制。探针Lyso-LCL的光谱研究表明:随着溶剂极性的增大,探针的荧光发射峰发生明显红移,且荧光强度下降。Lyso-LCL对不同溶剂的极性十分敏感,能够对不同溶剂极性的变化做出响应,可以作为一种检测极性的探针。同时,Lyso-LCL还具有双光子吸收性质,并可以发射双光子诱导荧光。在820 nm处,具有最大的有效双光子吸收截面为126 GM。探针Lyso-LCL具有低毒性,可成功靶向于溶酶体,与溶酶体商品化染料的共定位系数高达0.93。因此,Lyso-LCL可作为新型的极性荧光探针,用于细胞溶酶体靶向成像。