储藏对稻谷代谢产物的影响研究

程晓雨, 盛亚男, 冯玉超, 王长远,2

(黑龙江八一农垦大学食品学院1,大庆 163319) (国家杂粮工程技术研究中心2,大庆 163319)

稻谷作物是中国乃至全世界种植广泛的主要谷物之一,是目前全世界一半以上人口消费的主食。稻谷的品质除自身的遗传因素影响外,其生长、生产以及流通过程也会对其造成影响。尽管少部分稻谷作物被用作食品原料和饲料成分,但大部分仍用作米饭食用,这种使用方式导致需要对稻谷在不同时期内进行储藏。而在市场流通中,新米因其优良的营养品质和味道,深受消费者喜爱,而新米从稻谷收割到加工成为大米在市场流通之前,要对收割的稻谷进行储藏,这个过程中稻谷的代谢活动仍在进行,因此稻谷会发生陈化[1],储藏时间越长,陈化现象越严重,所以新米会变成陈米,相应地其品质也会不可避免地发生劣变[2]。稻谷中含有丰富的淀粉[3]、氨基酸[4]和蛋白质[5-7]等营养物质,而储藏过程中,稻谷中的淀粉、脂肪及蛋白质会发生分解、氧化等物理、化学变化,从而影响大米的食味品质[8-10]。Bolting等[11]发现陈化米的蛋白含量要低于新米,与此同时新米的米饭口感优于陈米,通过研究蛋白质的一级结构在储存期间的变化,推测储藏期间起到作用的物质之一是米粒外面的蛋白质。研究指出稻米的米糠外层在储存过程中直接暴露在外部环境中,则储藏过程中敏感脂质会发生变化[12]。代谢产物是植物应对外界环境变化产生应答的终端产物,环境不同,代谢途径及产物也不尽相同[13,14]。储藏过程中稻谷籽粒内的代谢仍然持续进行,储藏环境与生长环境存在很大差异,故生长过程中形成的优良品质在储藏过程中将会随着稻谷籽粒代谢的变化而发生一定的改变,从而影响其品质。

代谢组学是对生物样品中所有低分子质量分子(代谢物)进行定性和定量研究的学科,包括氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、维生素和脂类等[15,16]。代谢组学近年迅速发展,在生物技术和农业以及营养食品科学[17,18]等多个研究领域已经变得越来越重要[19]。目前,对于稻谷储藏的研究主要有两大方向,一是研究储藏对稻米中蛋白质、脂肪酸等大类成分含量的变化探究储藏对品质的影响[20,21],二是调节储藏条件尽可能延缓稻米品质劣变[22-25]。除此外还有对储藏过程中稻米挥发物变化研究的报道[26]。但目前利用代谢组学的手段对储藏后稻谷代谢产物变化的研究较少,通过对储藏前后代谢产物的定性定量,不仅可以将稻谷籽粒各类物质的变化具体化,还可以筛选出储藏影响的关键代谢通路及关键物质,反映出机体代谢的动态变化,将有助于新米变陈米过程中稻米品质变化的机理研究。

故本研究基于GC-MS[27]的代谢组学平台,对查哈阳地区2021年稻谷样本以及储藏1年后的2021年稻谷样本进行代谢组学分析,对代谢物进行定性和定量,并从内源代谢物的角度分析储藏期内稻谷代谢产物的变化情况,应用PCA、OPLS-DA等多元统计分析方法,结合层次聚类分析以及代谢通路分析方法,探讨储藏引起的稻谷品质变化的内在机理,以便于对稻谷在储藏过程中产生的品质变化进行可视化监控,保证其营养价值,同时可为稻谷的储藏与品质监测以及优化稻谷储藏条件、延长稻谷储藏期提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稻谷样本来源于黑龙江省查哈阳地理标志稻米保护区,依据五点采样法在保护范围内进行随机采集,样本数为30个,稻谷品种主要为龙粳26、龙粳29、龙粳31、绥粳4、松粳9。将收集到的稻谷样本清洗干净,并风干至水分质量分数14%～15%,在稻穗顶部相同位置将稻谷脱粒,后置于尼龙网袋中,储藏在阴凉通风温度在18 ℃左右的储存室中,每10 d翻动1次,查看籽粒是否发生霉变。样本共分为2组,一组为2021年的稻谷样本(简称2021年样本),另一组为储藏1年后的2021年稻谷样本(简称储藏样本)。

甲醇(色谱纯)、吡啶(纯度≥99.9%);N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺[N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide,BSTFA,含1%三甲基氯硅烷]、甲氧基胺盐酸盐(纯度98%)。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C GC-MS,色谱柱HP-5 ms(30 m×0.25 mm,0.25 μm),DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱,恒温箱,TGL-16B台式离心机。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

为确保实验结果的准确性,在相同时间和条件下检测了2021年样本和储藏样本。将2021年样本用液氮淬灭以终止代谢活动,并于-80 ℃下储存,1年后与储藏样本一起分析。样本制备参考Feng等[28]的方法进行:将稻谷籽粒用液氮研磨后称取粉末50 mg,加入800 μL甲醇,并加入10 μL内标(2.9 mg/mL二氯苯丙氨酸),涡旋混匀30 s,而后置于4 ℃离心机中,12 000 r/min离心15 min,吸取200 μL上清液,转入进样小瓶中氮气吹干。衍生化:称取20 mg甲氧胺盐酸盐溶于1 mL吡啶,取30 μL甲氧氨盐酸吡啶溶液至浓缩后的样品中,并涡旋混匀至完全溶解,置于37 ℃恒温箱90 min,取出后加入30 μL BSTFA,置于70 ℃烘箱60 min,取出后待检测。

1.3.2 GC-MS条件

色谱柱:Agilent J&W Scientific HP-5ms(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:初始温度80 ℃,维持2 min,以10 ℃/min升温至320 ℃,并维持6 min;高纯氦气(纯度大于99.999%)作为载气,不分流进样,进样量1.0 μL。进样口温度280 ℃,电子电离源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃。采用全扫描模式,检测范围50～550m/z。

1.3.3 代谢物的定性

根据保留时间及质核比(m/z)在Fiehn数据库中查找与其匹配的物质,获得定性物质原始数据。定性物质与标准数据库物质之间的匹配程度被用作相似性的指标,最佳分数是1 000分,分数越接近1 000表示定性物质更准确。

1.3.4 数据分析

通过G1701MSD ChemStation软件(E.02.00.493)将定性获得的原始数据转换成netCDF格式,利用R(v3.3.2)软件提取特征峰并进行预处理,得到具有质核比、保留时间、峰面积等信息的数据矩阵和总峰面积归一化处理,保证不同量级的数据能够进行有效比较;通过SIMCA软件(V14.1)进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)及置换检验等多元统计分析。

通过层次聚类分析对数据集进行缩放,同时对样本和代谢物进行双向聚类。差异代谢物筛选以学生t检验的P值小于0.05,同时OPLS-DA 模型以VIP >1为标准。差异代谢物层次聚类分析对分析得到的差异代谢物进行定量值计算欧式距离矩阵,以完全连锁方法对差异代谢物进行聚类,并以热力图进行差异可视化展示。

KEGG注释以及代谢通路分析将差异代谢物在Pathway数据库进行检索,找到所有差异代谢物参与的通路后,通过差异代谢物对 KEGG、PubChem 等权威代谢物数据库进行映射,在取得差异代谢物的匹配信息后,对对应物种Oryzasativajaponica的通路数据库进行搜索和代谢通路分析,从而找到与代谢物差异相关性最高的关键通路。

2 结果与分析

2.1 代谢产物定性结果

对GC-MS原始数据进行处理,在2021年样本(2021CHY)和储藏样本(ZCCHY)中分别检测出318和332个峰。从图1a和图1b的2组稻谷样本的典型离子流色谱图中可以看出,与2021年样本相比,储藏样本在12.5～17.5 min时峰数明显增多,7.5～10.0 min、20.0～22.5 min的峰值明显增加。

利用Fiehn数据库对代谢物进行定性,2021年样本与储藏样本分别定性出147和148个的代谢产物,2组样本共定性到174个代谢产物。代谢物详细情况见表1。

由表1可知,2组样本同时存在的代谢物121个,在2021年样本中没有而在储藏样本中存在的代谢物有27个,在2021年样本中存在而储藏样本中不存在的代谢物有26个。虽然2组样本定性到的代谢物数量相差不大,但各组分代谢物有所改变并且所占比例存在一定差异。在储藏后糖类及其衍生物在全部代谢物的占比由27.21%减少至27.03%,脂肪酸及其衍生物占比由22.45%减少至20.27%,醇类物质由10.20%减少至9.46%,氨基酸及其衍生物由7.48%减少至7.43%,醛类物质由3.40%减少至2.70%,胺类物质由2.72%增加至3.38%,酚类物质由6.12%增加至8.78%,其他物质(酸、吡啶、嘌呤、腈、酮、烷烃、未知物)由20.41%增加至20.95%。有研究表明,氨基酸大致可分为苦味氨基酸、鲜味氨基酸和甜味氨基酸,天冬氨酸属鲜味氨基酸在储藏后产生,苏氨酸属甜味氨基酸并在储藏后消失,储藏前后2种氨基酸种类的变化可能会导致稻米的滋气味发生改变[29]。储藏后脂肪酸及其衍生物的数量减少,可能是储藏过程中脂肪酸出现代谢转化情况,花生四烯酸是人体的一种必需脂肪酸,可从2种途径进行补充,一种是通过亚油酸转化而获得,另一种是通过食物来获得[30,31],在储藏后未检测到该物质。糖类是谷物重要的营养成分之一[32],对稻米的食味品质也具有一定影响,储藏后该类物质数量占比稍微减少,说明储藏过程中糖类物质也发生了代谢。脂肪酸是谷物品质好坏的重要指标[33,34],长时间的储藏会使脂肪酸发生氧化,从而产生酚类、酮类、醇类和酸类等物质,造成口感以及气味上的劣变,使稻谷的品质降低[35]。储藏后稻谷的脂肪酸类物质数量减少较多,而酚类、胺类以及其他物质增加较多,说明脂肪酸类物质可能发生了氧化、分解等过程。醛类物质数量上减少较多,醛类对稻谷滋气味也具有较大影响,说明储藏后稻谷的滋气味发生了改变。

图1 典型样本离子流色谱图

表1 查哈阳地区代谢物定性结果

2.2 多元统计分析

图2 21CHY与ZCCHY对比的PCA模型得分散点图

图3 21CHY与ZCCHY对比的OPLS-DA模型得分散点图

图4 21CHY与ZCCHY对比的OPLS-DA模型的置换检验结果

2.3 差异代谢物的筛选和聚类分析

采用OPLS-DA模型的VIP值(阈值>1)与学生氏t检验的P值(阈值≤0.05)相结合的方式来筛选差异代谢物。通过保留时间等条件与Fiehn数据库中的物质进行匹配,从而进行物质差异性代谢物的定性,差异代谢物定性结果如表2所示,共筛选出39个差异代谢物。

差异代谢物是指2021年样本和储藏样本中同时存在,但是含量上存在较大差异的代谢物。由表2可知,2021年样本与储藏样本相比,差异代谢物含量下降的有30个,含量上升的有9个。差异代谢物含量相对下降的代谢物中脂肪酸及其衍生物4个,糖类及其衍生物3个,其他类物质2个。差异代谢物含量相对上升的代谢物中脂肪酸及其衍生物5个,糖类及其衍生物4个,氨基酸及其衍生物3个,醇类及其衍生物3个,胺类物质2个,酚类物质2个,其他类物质11个(酸类物质2个)。数据表明,储藏过程中各类代谢物的含量都会发生显著变化。脂肪对于提升稻米食味品质具有积极影响,较高脂肪含量的稻米蒸煮后,各项食味评价指标表现均较佳[36]。但在稻米的储藏过程中,脂肪在环境作用及相关酶的影响下,会发生酸变,最终导致稻米陈化,品质下降[37]。赵卿宇等[38]研究发现,葡萄糖和果糖等单糖与味感得分呈强负相关,在差异代谢物中发现葡萄糖在储藏后显著增加,这可能是稻谷在储藏后口感变差的原因之一;氨基酸的含量不同,会导致大米味感和品质存在差异,而大米味感特征是多种呈味物质综合反映的结果,这些物质之间存在协同性与制约性,一种物质的增多或减少会引起其他物质味感特征强度的变化。脂肪酸在自动氧化时会产生多种氧化产物,例如酚类、酮类、醇类和酸类等,这些氧化产物会产生特殊的气味,导致食物品质发生劣变[39],在油脂酸败后,醛类物质是特殊气味的主要成分[38]。外观品质是稻米商业价值的重要参考之一,是指糙米或者精米的外表物理特性,包含垩白、透明度、粒形等评价指标[40]目前发现脂肪含量高的稻米表现出油质鲜明的特征[41]且脂肪含量与稻米粒长、粒宽、长宽比呈显著的正相关关系[42]。在储藏后脂类氧化物的含量显著增加,这可能与稻谷品质的劣变有关。储藏可使得稻米中代谢产物含量发生显著变化,且不同种类代谢产物含量的变化与品质的劣变具有显著的相关性。

表2 2021年样本与储藏样本的差异代谢物列表

差异代谢物之间可能在代谢通路中受到同一个代谢通路的正、负调控,从而在2组样本中表达出相同或者相反的特征。层次聚类分析可以将具有相同特征的代谢物进行归类,进而发现2组样本间含量变化情况。

图5为2021年查哈阳样本与储藏样本的层次聚类分析热图。共有60个样本,2021年样本和储藏样本各30个,分别位于图5的左侧和右侧。可以看出,2021年样本和储藏样本两区域均可以分成4个部分,一部分为各样本的前9个差异代谢物,下面30个差异代谢物在各样本区域可分成左中右3个部分。在前9个差异代谢物中,2021年样本在储藏后其区域颜色由低表达变成高表达。下面30个代谢物分成的区域中,2021年样本的左侧和右侧区域在储藏后其区域颜色均由高表达变成低表达,而中间区域在储藏后无明显的变化。从整体上来看,代谢物的高、低表达区域发生对调,即储藏后稻谷的代谢物含量发生逆向的转变。代谢物含量的变化,可能与稻谷品质相关。未知物85、未知物87和未知物117相邻,聚类到甘油、松柏醇和环己胺,说明这3个未知物可能属于中间衍生物类物质。未知物441处于二十四烷左右,说明未知物441可能为烷烃类物质。

注:图中横坐标代表不同实验分组,纵坐标代表该组对比的差异代谢物,不同位置的色块代表对应位置代谢物的相对表达量,红色表示该物质在所在组含量高表达,蓝色表示该物质在所在组含量低表达。A为3-(4-羟基苯基)丙酸邻苯甲酸。图5 21CHY与ZCCHY对比的层次聚类分析热力图

2.4 差异代谢物的代谢通路分析

通过KEGG检索后,筛选出差异代谢物参与的代谢通路共15条,分别为稻谷代谢途径(Refseq),脂肪酸生物合成、ABC转运蛋白、戊糖和葡萄糖醛酸交换、半乳糖代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、单抗生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、甘油脂代谢、泛酸和辅酶A生物合成、硫代谢和次生代谢产物的生物合成。通过对应物种Oryzasativajaponica的通路数据库进行搜索和代谢通路分析,最终筛选出与代谢物差异相关性最高的8条通路,分别是脂肪酸生物合成、硫代谢、β-丙氨酸代谢、甘油酯代谢、泛酸盐和辅酶A生物合成、半乳糖代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢,并有5个代谢物命中这8条代谢通路,分别为棕榈油酸、月桂酸、硫酸盐、脲基丙酸和甘油。详细信息见表3。

气泡的颜色代表富集分析的P值(取负常用对数),颜色越深P值越小,富集程度越显著,即气泡颜色越深说明对两组稻谷样本有越大的影响。由图6可知,脂肪酸生物合成的气泡颜色最深,硫代谢、β-丙氨酸代谢、甘油酯代谢以及泛酸盐和辅酶A生物合成的气泡次之,半乳糖代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢颜色相对较浅。与这8个途径相关的5个代谢物中,棕榈油酸、脲基丙酸和月桂酸都是脂肪酸,甘油和硫酸盐是中间衍生物,并且棕榈油酸、脲基丙酸、月桂酸和甘油均属于脂类,说明储藏对稻谷脂类物质有重要影响。

表3 2021年样本与储藏样本的差异代谢物列表

图6 通路分析气泡图

脂肪酸生物合成途径会消耗ATP,合成超长链脂肪酸而存在某些种子油中或位于种子表面,从而保护种子防止食草性昆虫侵蚀以及抵御环境破坏(霜冻、紫外线迫害、干旱)等方面发挥重要作用[43]。在此途径中棕榈油酸作为一种抗低温脂肪酸,在温度变低的情况下其含量会有所增加[44],稻谷生长温度大致25 ℃左右,而储藏室温度为18 ℃。这与本实验检测的结果一致。综合看来,脂肪酸在稻谷储藏过程中受到的影响最大,即脂肪酸代谢与储藏中稻谷品质变化的影响具有较大的相关性。

3 结论

基于GC-MS代谢平台对储藏前后的稻谷样本进行研究,可从内源代谢产物的角度分析储藏对稻谷代谢及其品质的影响。研究发现,储藏对代谢物的数量影响不大,但对代谢物种类比例具有较大影响。在含量上,储藏对稻谷代谢产物的影响很大,其中对脂类物质影响最大,棕榈油酸、脲基丙酸、月桂酸、甘油和硫酸盐这5个代谢产物是导致稻谷品质劣变的重要代谢产物,可作为进一步靶标代谢组学的主要目标物。层次聚类分析表明,储藏后稻谷样本代谢物含量会发生反向变化,即高变低、低变高。代谢通路分析结果显示,储藏对脂类物质的代谢的影响最显著。因此,储藏会使代谢物的数量、代谢物的含量以及各类代谢物所占比重发生变化,这些变化与稻谷品质劣变有较大相关性。