雷公藤甲素对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞线粒体自噬、NLRP3 炎症小体活化和细胞焦亡的影响

康艳慧，穆萍萍，张海雷

1.北京大学第一医院太原医院 太原市中心医院 风湿免疫科，山西 太原 030001

2.北京大学第一医院太原医院 太原市中心医院 病理科，山西 太原 030001

3.太原市第四人民医院 内科，山西 太原 030053

类风湿关节炎是一种慢性进行性的自身免疫性关节疾病，具有高发病率和高致残率的特征。类风湿关节炎患者主要病因是成纤维样滑膜（FLSs）细胞异常增殖和炎症因子大量释放，进而破坏患者关节局部结构，最终导致关节畸形和功能障碍[1]。雷公藤是一种临床上用于治疗风湿性关节炎的传统中草药，而雷公藤甲素是从雷公藤中分离鉴定出的一种主要活性成分，目前已有的研究表明，雷公藤具抗类风湿、抗炎症等作用，降低炎症因子白细胞介素（IL）-18 和IL-1β 水平[2-3]。因此，雷公藤甲素治疗类风湿关节炎具有一定疗效，但其具体的作用机制尚不明确。近期，有研究表明雷公藤能够通过抑制LC3B 蛋白表达，增强p62 表达抑制线粒体自噬，同时还减少NLRP3 表达进而缓解结肠炎引发的炎症损伤[4]。NLRP3 的表达和细胞焦亡息息相关，并且在类风湿关节炎滑膜组织中检测到细胞焦亡相关蛋白GSDMD-N 表达显著上调[5]。基于此，本研究通过比较不同质量浓度的雷公藤甲素对类风湿关节炎FLSs 细胞线粒体自噬、NLRP3 炎症小体的活化和细胞焦亡的影响，探讨雷公藤甲素治疗类风湿性关节炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

FLSs 细胞（货号ZY-R025）和类风湿关节炎FLSs 细胞（货号HZ-H197）购自上海沪震生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

雷公藤甲素（质量分数≥98%，货号38748-32-2）购自上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO，货号01934-1L）购自Sigma-Aldrich 公司；青霉素–链霉素溶液（货号SV30010）、DMEM（货号SH30022.01B）培养基购自Hyclone；细胞焦亡检测试剂盒（货号为ab39412）购自Abcam 公司；IL-1β、IL-18 ELISA 检测试剂盒（货号JC-E1109、JCA04206）购自上海机纯实业有限公司。本研究所用抗体微管相关蛋白 1 轻链 3B（LC3B，货号ab192890）、聚集素-1（p62，货号ab109012）、抑制素2（PHB2，货号ab182139）、NOD 样受体蛋白3（NLRP3，货号 ab263199）、噬菌体溶解素 D（GSDMD，货号ab219800）、噬菌体溶解素D N-末端片段（GSDMD-N，货号ab215203）、糖酵解酶（GAPDH，货号ab8245）、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor®488；货号ab150077）和Goat Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor®488；货号150113）均购自英国Abcam 公司。超敏ECL 化学发光试剂盒（货号P0018M）购自北京碧云天生物技术有限公司。

3111 型CO2细胞培养箱购自美国热电公司，HT 型酶标仪购自美国Bio-Tek 公司，CytoFLEX 型流式细胞仪购自美国Beckman 公司，24KS 型电泳仪购自北京六一公司，TE22 型转膜仪购自美国Hoefer 公司。

1.3 细胞培养

将FLSs 细胞和类风湿关节炎FLSs 细胞置于含有10% FBS、100 μg/mL 青霉素–链霉素的DMEM液体培养基中培养，并确保培养温度为37 ℃、50%CO2。将培养3～8 代后的细胞用于后续实验。

1.4 蛋白质印迹法（Western blotting）检测细胞线粒体自噬、NLRP3 炎症小体激活和细胞焦亡相关蛋白的表达

类风湿关节炎FLSs 细胞采用0、10、20、40 ng/mL 雷公藤甲素处理48 h，FLSs 细胞添加等量的二甲基亚砜后常规培养48 h。细胞通过胰蛋白酶消化后，用磷酸缓冲液冲洗3 次后重悬细胞，用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，使用SDS-PAGE上样，电泳并转膜后，将蛋白膜放置到预先准备好的洗涤液中，封闭，之后加入以下抗体进行孵育：LC3B（1∶1 000；Abcam）、p62（1∶1 000；Abcam）、PHB2（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、GSDMD-N（1∶1 000）或GAPDH（1∶1 000），洗涤后，加入以1∶20 000稀释的以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG H&L 或羊抗鼠IgG H&L 二抗，室温孵育1 h后，用ECL 发光试剂进行蛋白检测。

1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测NLRP3 炎症小体相关通路、IL-1β 和IL-18 的水平

取雷公藤甲素（0、10、20、40 ng/mL）或二甲基亚砜处理后的类风湿关节炎FLSs 和FLSs 细胞的上清，按照ELISA 试剂盒说明书测定各组中IL-1β和IL-18 水平。

1.6 流式细胞术检测细胞焦亡

类风湿关节炎FLSs 细胞采用不同浓度的雷公藤甲素（溶解于二甲基亚砜，使终浓度分别达到0、10、20、40 ng/mL[6]）处理48 h，FLSs 细胞添加等量的二甲基亚砜后常规培养48 h。根据细胞焦亡检测试剂盒说明指导，用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1）检测试剂盒和碘化丙啶（PI）检测试剂盒标记各组细胞（6×104个/孔）并采用流式细胞仪检测分析，统计Caspase-1＋PI＋细胞个数占总细胞个数的百分比即记为细胞焦亡水平[7]。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 雷公藤甲素对线粒体自噬线粒体的影响

与FLSs 组相比，类风湿关节炎FLSs 组细胞的线粒体自噬相关蛋白LC3B 表达升高，p62 和PHB2的表达显著降低（P＜0.001）。采用10、20、40 ng/mL雷公藤甲素处理类风湿关节炎FLSs 后，发现雷公藤甲素各剂量组均能显著下调类风湿关节炎FLSs细胞的线粒体自噬相关蛋白LC3B 的表达，上调p62和PHB2 的表达（P＜0.05、0.01、0.001），且呈剂量相关性，见图1。

图1 雷公藤甲素对线粒体自噬线粒体的影响（，n=3）Fig.1 Effect of triptolide on mitochondria autophagy (,n=3)

2.2 雷公藤甲素对NLRP3 炎症小体激活情况的影响

与FLSs 组相比，类风湿关节炎FLSs 组NLRP3表达水平显著升高（P＜0.001）。与类风湿关节炎FLSs 组相比，雷公藤甲素各剂量组NLRP3 表达水平均显著降低（P＜0.01、0.001），且呈剂量相关性，见图2。

图2 雷公藤甲素对类风湿关节炎FLSs 细胞NLRP3 炎症小体激活的影响（，n=3）Fig.2 Effect of triptolide on activation of NLRP3 inflammasome in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.3 雷公藤甲素对炎症因子IL-1β 和IL-18 水平的影响

与FLSs 组相比，类风湿关节炎FLSs 组炎症因子IL-1β 和IL-18 水平显著升高（P＜0.001）。与类风湿关节炎FLSs 组相比，雷公藤甲素各剂量组的IL-1β 和IL-18 水平均显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈剂量相关性，见图3。

图3 雷公藤甲素对类风湿关节炎FLSs 细胞IL-1β 和IL-18 水平的影响（，n=3）Fig.3 Effect of triptolide on IL-1β and IL-18 levels in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.4 雷公藤甲素对细胞焦亡水平的影响

与FLSs 组相比，类风湿关节炎FLSs 组细胞焦亡率显著升高（P＜0.01）。与类风湿关节炎FLSs 组相比，雷公藤甲素各剂量组细胞焦亡率显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈剂量相关性，见图4。

图4 雷公藤甲素对细胞焦亡水平的影响（，n=3）Fig.4 Effect of triptolide on pyroptosis in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.5 雷公藤甲素对细胞焦亡相关蛋白表达的影响

与FLSs 组相比，类风湿关节炎FLSs 组细胞GSDMD 蛋白表达显著降低，GSDMD-N 蛋白的表达显著升高（P＜0.001）。与类风湿关节炎FLSs 组相比，雷公藤甲素各剂量组细胞GSDMD 蛋白表达显著上升，GSDMD-N 蛋白表达下降（P＜0.05、0.01、0.001），且呈剂量相关性，见图5。

图5 雷公藤甲素对细胞焦亡相关蛋白表达的影响（，n=3）Fig.5 Effect of triptolide on pyroptosis-related proteins expression (,n=3)

3 讨论

雷公藤性寒，具有祛风湿、消肿解毒、通经活络的功效[8]。其中，雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分之一，是一种治疗类风湿关节炎的潜在药物。正常FLSs 是一种能够分泌滑液使关节润滑，防止关节黏连的一类细胞。但是，类风湿关节炎患者FLSs 不仅异常增殖和侵袭，而且能释放大量致炎因子介导关节破坏，最终对患者造成不可逆的关节损伤[9]。线粒体自噬是一种修复细胞损伤，维持细胞稳态的一种方式，它主要的作用机制是通过调节线粒体的融合和分裂，清除发生损伤或多余的线粒体，促进细胞内线粒体的更新，维持细胞内线粒体的动态平衡[10]。近期研究发现，外湿可以加剧类风湿关节炎大鼠的线粒体自噬和损伤线粒体的堆积[11]。本研究发现，类风湿关节炎FLSs 与FLSs 相比，线粒体自噬相关蛋白LC3B 表达升高、p62 和PHB2 的表达显著降低，表明线粒体自噬水平增强。究其原因，可能是由于类风湿关节炎FLSs 细胞为了维护细胞稳态则增强线粒体自噬水平，代偿细胞损伤机制。在线粒体自噬中，p62 和LC3B 蛋白分别发挥着标记并聚集受损蛋白和线粒体的作用，并能参与和促进自噬小体的形成。而PHB2 是分布于线粒体内膜上的蛋白，其独有的LC3 结构域能够帮助受损的线粒体被自噬小体锚定并降解[12]。本研究发现，雷公藤甲素能够抑制LC3B 蛋白表达上调，同时增强p62 和PHB2 表达，表明雷公藤甲素能够减弱线粒体自噬水平，类风湿关节炎引发的线粒体自噬水平失衡得到缓解。

研究指出，线粒体是NLRP3 功能的中心调控因子，线粒体DNA 的释放可以促进NLRP3 炎症小体的组装和激活[13]。当NLRP3 炎症小体活化后，通过转录因子核因子-κB（NF-κB）轻链增强子激活的B 细胞触发pro IL-1β 和pro IL-18 的表达，最终诱导促炎因子IL-1β 和IL-18 的成熟和分泌[14]。本研究发现，类风湿关节炎在促进FLSs 线粒体自噬的同时，还能增强NLRP3 的表达，表明类风湿性关节炎可能通过促进线粒体自噬促进NLRP3 炎症小体的活化。此外，进一步研究发现，类风湿性关节炎还能促进IL-1β 和IL-18 炎症因子的表达，激活炎症反应。雷公藤甲素是一种抗炎中药，在给予不同剂量的雷公藤甲素处理后，类风湿关节炎FLSs 细胞的NLRP3 炎症小体的活化作用被有效地抑制，部分恢复到正常FLSs 细胞的水平，表明雷公藤甲素能够作为类风湿关节炎的潜在药物可能是通过抑制线粒体自噬，进而抑制NLRP3 炎症小体的活化作用，最终抑制促炎症因子高表达引发的炎症反应。临床上，类风湿关节炎患者检出滑膜组织的NLRP3 炎症小体被显著激活，并发现IL-1β 和IL-18 的高表达，这与本研究结果一致[15-16]。

细胞焦亡是一种特殊的细胞死亡方式，其特征为细胞核溶解、细胞膜溶胀以及细胞质和其内容物外泄。细胞焦亡的最经典途径是依赖于Caspase-1 介导的，而GSDMD 是最主要的效应分子。Caspase-1可以通过裂解GSDMD，产生GSDMD-N 作为活性结构，在细胞膜上聚合形成孔道，增强细胞膜的通透性和细胞溶胀，最终导致细胞发生焦亡。此外，GSDMD-N 形成的孔道也是释放炎症因子的重要途径之一[17]。本研究发现，类风湿关节炎FLSs 细胞中GSDMD 表达降低，而GSDMD-N 表达显著升高，表明类风湿关节炎能够促进细胞焦亡。最新研究发现，新风胶囊能抑制FLSs 细胞焦亡，同时下调炎症细胞因子分泌，减轻关节局部炎症反应[18]。同样本研究也发现，雷公藤甲素能够有效地抑制细胞焦亡，同时观察到焦亡相关蛋白GSDMD 表达升高，GSDMD-N 降低，表明雷公藤甲素通过抑制GSDMD 的裂解抑制细胞焦亡。

综上所述，雷公藤甲素能通过抑制线粒体自噬、NLRP3 炎症小体激活和细胞焦亡，抑制细胞炎症反应。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突