生物信息学和实验验证探究千层纸素A 抗宫颈癌的效应及其作用机制

王珏

宿迁市第一人民医院 药学部，江苏 宿迁 223800

宫颈癌是一种始发于宫颈细胞的癌症，但其通常会随着时间的推移而缓慢发展[1]。发育异常的子宫颈细胞首先出现在子宫颈组织中，随着时间的推移，如果不进行干预或清除，异常细胞可能会变成癌细胞，并开始生长和扩散到更深的子宫颈和周围组织[2]。在目前的研究表明，宫颈癌多由高风险类型的人类乳头瘤病毒（HPV）诱发，其中HPV16、HPV18 占到了70%[3]。定期接受宫颈癌筛查和接种HPV 疫苗被认为是预防宫颈癌发生的有效手段[4]，但目前这2 种手段在我国的普及率较低[5]。目前治疗宫颈癌的常规手段为手术治疗、化疗、放射疗法及靶向治疗[6-7]。千层纸素A 是一种从黄芩根皮中所提取的活性成分，多项研究表明千层纸素A 具有抗肿瘤、抗炎、神经调节等多种药理作用[8-10]。

SHC SH2 结构域结合蛋白1（SHCBP1）是细胞表面受体的重要蛋白[11]，它将激活的生长因子受体偶联到表皮生长因子受体（EGFR）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）和胰岛素受体等相关信号通路[12]。SHCBP1 在多种癌症中如肝癌、乳腺癌、胶质瘤中过表达，目前有研究表明SHCBP1 的表达还与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和免疫抑制基因（TGFBR1、PD-L1、TGFB1 等）呈正相关[13-15]，表明SHCBP1 与肿瘤免疫有着密切的关系。

目前对于千层纸素A 抗肿瘤作用研究得到了重点关注，但其作用的机制仍有待研究。本研究通过MTT 比色法证实了千层纸素A 可以抑制宫颈癌细胞的增殖，并基于前期研究的基础，通过Western blotting 实验分析千层纸素A 与SHCBP1 之间的关系。此外，对千层纸素A 与SHCBP1 进行计算机模拟分子对接，分析结合效能。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

HeLa 细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司；千层纸素A（质量分数≥98%，货号480-11-5）购自成都普思生物科技股份有限公司；SHCBP1 抗体（货号12672-1-AP）购自美国Proteintech 公司；DMSO（货号ST038）、MTT 毒性检测试剂盒（货号C00098）、PBS（货号C0221A）购自上海碧云天生物技术股份有限公司；DMEM 培养基（货号6122692）购自美国Gibco 公司；胎牛血清（货号11011-8611）购自浙江天杭生物科技股份有限公司。

超精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、多功能微孔板检测仪（美国伯腾仪器有限公司）、双红外激光色成像仪（美国LI-COR 公司）；电泳仪（美国BIO-BAD 公司）。

1.2 数据集的研究

通过GEO 和TCGA 数据库检索人宫颈癌相关数据集，最终选定GSE9750、GSE63678、GSE29570和人宫颈癌TCGA 数据（TCGA-CESC）作为研究数据集，其中对GSE63678 中非宫颈癌样本进行删除。通过R 语言分别对GSE9750、GSE63678、GSE29570 进行整理获得基因表达矩阵，运用生物医学数据分析盒子（Sangerbox）[16]中COMBAT 法对3 个数据集进行去批次效应处理，获得可进行比较的3 个数据集基因表达矩阵集合，之后在基因表达矩阵中分析SHCBP1的表达量。同时，通过GEPIA 2 平台（http://gepia2.cancer-pku.cn）[17]对TCGA 数据库中TCGA-CESC 进行研究，分析SHCBP1 在TCGA 数据库中的表达；使用R 语言中IOBR 包在3 个GEO 数据集中，对22 种免疫细胞进行Cibersort法分析。采用TISIDB 数据库（http://cis.hku.hk/TISIDB）[18]分析SHCBP1 与免疫检查点的联系。

1.3 分子对接

分别在AlphaFoldDB 和TCMSP 数据库中检索SHCBP1 和千层纸素A 的PDB 格式与MOL2 格式文件，Pymol 对小分子与蛋白进行脱水等处理，后导入Autodock 软件中进行分子模拟对接，将势能最低的一个结果使用Pymol 进行可视化输出。

1.4 MTT 实验

1.4.1 含药培养基配制 用精密天平精准称定2 mg千层纸素A，根据相对分子质量加入相应体积的DMSO 溶液配制成60 mmol/L 储备液，通过稀释法配制浓度为10、20、30 mmol/L 的含药母液。

1.4.2 培养细胞 HeLa 细胞在含有5%胎牛血清的DMEM 培养基中培养，经传代后，以每孔1×104个接种入96 孔板中，每组副孔6 个，培养至70%～80%的密度。

1.4.3 加药 取3 个5 mL 离心管，分别加入2 mL培养基，取2 μL 浓度为10、20、30 mmol/L 的含药母液分别加入含培养基的离心管内，即为10、20、30 μmol/L 含药培养基，另取一对照管加入相应体积的DMSO。吸干原96 孔板中培养基，加入200 μL含药培养基，继续培养24 h。

1.4.4 收样 加入10 mL MTT 溶液（5 mg/mL）培养4 h，弃掉原培养基加入200 μL DMSO 溶液，充分溶解甲臜40 min 后490 nm 处测吸光度（A）值。

1.5 蛋白免疫印记实验

HeLa 细胞在10、20、30 mmol/L 含药培养基下培养24 h，对照组培养基加入相应体积DMSO 同步培养，用含有1%的蛋白酶抑制剂（PMSF）的NP40裂解缓冲液提取HeLa 细胞的蛋白。采用BCA 法测定蛋白浓度。以30 μg 的蛋白量加入10%的胶中，100 V 条件下分离，在240 mA 下转印90 min，经封闭、洗膜、敷抗体等步骤后显影。

1.6 共表达网络分析

通过Linkedomics[19]（http://www.linkedomics.org）获取SHCBP1 共表达基因网络，并以热图的形式进行可视化。并通过基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）进一步分析SHCBP1 的生物学功能。

1.7 数据分析

数据采用R4.3.1 和GraphPad Prism 8 进行分析。使用Wilcoxon 秩和检验分析SHCBP1 的表达情况；使用斯皮尔曼的相关性分析来评估相关性。

2 结果

2.1 SHCBP1 在宫颈癌中的表达情况

由于GEO 数据库中的数据通常来自不同的实验室、不同的实验平台和不同的时间点，因此存在很大的差异性。为了消除这些非生物学的技术性差异，需要对数据进行标准化处理，同时对于不同批次的GEO 数据还要进行去批次效应处理，使得各组数据具有可比性。首先对GSE9750、GSE63678、GSE29570 数据库进行标准化和COMBAT 去批次，处理后的数据集中138 组数据（宫颈癌患者92 组，健康人46 组）几乎在同一水平线上，均一性好，该组数据集的芯片数据可靠，可进行后续分析。经过线性模型拟合、贝叶斯检验，获得差异表达基因（DEGs），使用ggplot2 和cowplot 包绘制火山图（图1-A）。使用ggpubr 对SHCBP1 在GSE9750、GSE63678、GSE29570 合集中的表达进行可视化（图1-B），结果显示，相较于健康受试者，宫颈癌患者的SHCBP1 显著上升（P＜0.001）；同时对TCGA数据库中307 例样本（宫颈癌患者304 组，健康受试者3 组）的分析中，也显示出相同的结果（P＜0.001）。

图1 宫颈癌中SHCBP1 的表达情况Fig.1 Expression of SHCBP1 in cervical cancer

2.2 千层纸素A 对HeLa 细胞增殖和SHCBP1 蛋白表达的影响

结果显示，与对照组相比，千层纸素A 在10 μmol/L 时即可对HeLa 细胞显示出抑制作用；且各浓度千层纸素A 均可抑制SHCBP1 蛋白的表达（P＜0.05、0.001），见图2、3。

图2 千层纸素A 对HeLa 细胞增殖的影响（，n=6）Fig.2 Effect of oroxylin A on proliferation of HeLa cells(,n=6)

图3 千层纸素A 对SHCBP1 蛋白表达的影响（，n=3）Fig.3 Effect of oroxylin A on the expression of SHCBP1 protein (,n=3)

2.3 千层纸素A 与SHCBP1 结合能分析

千层纸素A 与SHCBP1 的VAL-109、THR-191、VAL-187、GLN-190 存在氢键作用（图4），其结合自由能为−7.3 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），该结果显示千层纸素A 与SHCBP1 蛋白可以在自然情况下进行结合，且对接结果良好。分子对接结果显示，千层纸素A 与SHCBP1 有较稳定的相互作用，进一步说明SHCBP1 蛋白可能为千层纸素A 抗宫颈癌的潜在重要作用靶点。

图4 千层纸素A 与SHCBP1 分子对接Fig.4 Molecular docking of oroxylin A with SHCBP1

2.4 SHCBP1 在CESC 中的生物学功能

为了进一步评估SHCBP1 在CESC 中的生物学功能，本研究通过Linkedomics 分析了SHCBP1 在CESC 中的共表达网络，共得到与SHCBP1 正相关基因453 个，SHCBP1 负相关基因387 个。将前50个的正相关和负相关的基因以热图形式进行展示（图5）。随后对SHCBP1 共表达网络进行GO 与KEGG 分析（图6），其中分子功能（MF）涉及激酶活性（kinase activity）、激酶结合（kinase binding）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）等；生物功能（BP）涉及细胞因子刺激的反应（cellular response to cytokine stimulus）、蛋白磷酸化反应（protein phosphorylation）、磷酸化的正向调节（positive regulation of phosphorylation）等；细胞组成（CC）涉及囊泡腔（vesicle lumen）、受体复合物（receptor complex）、细胞外基质（extracellular matrix）等。KEGG 结果显示，SHCBP1 及共表达基因富集在TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）等。

图5 SHCBP1 在CESC 中排名前50 个的正相关（A）和负相关（B）基因热图Fig.5 Heat map of the top 50 positively (A) and negative (B) correlated genes ranked by SHCBP1 in CESC

图6 SHCBP1 在CESC 中的GO（A）和KEGG（B）富集分析Fig.6 GO (A) and KEGG (B) analysis of SHCBP1 in CESC

2.5 SHCBP1 在CESC 免疫浸润和免疫检查点中的作用

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）可通过直接或间接作用参与肿瘤组织的发生、发展，是影响CESC 在内的各种癌症发展的独立因素。本研究通过CIBERSORT 算法计算了GSE9750、GSE63678、GSE29570 中22 种免疫细胞的比例（图7-A），发现活化的树突状细胞、静息的树突状细胞、M0 型巨噬细胞、M1 型巨噬细胞、静息肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞、NK 细胞、CD4+T 细胞、滤泡辅助性T 细胞的水平在CESC 中改变（图7-B），表明免疫细胞在宫颈癌的发生中起到重要作用。此外，将数据集集合分为SHCBP1 高、低表达组，在SHCBP1 高表达组中活化的树突状细胞、M0 型巨噬细胞、M1 型巨噬细胞、浆细胞、活化的CD4+T记忆细胞、滤泡辅助性T 细胞比例上调，调节性T细胞、肥大细胞、单核细胞、静息CD4+T 记忆细胞比例下调（图7-C）。通过TISID 数据库对SHCBP1与CESC 免疫检查点相关性分析得出，SHCBP1 与RAET1E、TGFB1、TGFBR1 表现出正相关，与TNFRSF14、LGALS9、VTCN1、CXCR4、HHLA2表现出负相关。这些结果表明，SHCBP1 可能参与了CESC 免疫的调控，见图8。

图7 GEO 数据集中免疫细胞比例（A）、免疫细胞浸润情况（B）和免疫细胞表达差异（C）Fig.7 Proportion of immune cells (A),infiltration of immune cells (B),and differences in immune cell expression (C) in GEO data sets

图8 SHCBP1 与CESC 中的免疫检查点之间的关系Fig.8 Relationship between SHCBP1 and immune checkpoints in CESC

3 讨论

从中药中分离和鉴定具有抗癌活性的化合物，成为宫颈癌的治疗的一种新的研究思路[20-21]。千层纸素A 作为一种从黄芩中提取到的活性化合物，在皮肤癌、乳腺癌、肺癌、肝癌中有显著抑制作用[8]，但在宫颈癌中的研究缺失。本研究表明，千层纸素A 可以浓度相关性地抑制Hela 细胞的增殖。此外基于前期的研究基础，本研究对千层纸素A 是否调控SHCBP1 开展了进一步的研究。通过对GEO 及TCGA 数据集的研究，发现SHCBP1 在宫颈癌中是显著高表达的，之后为了验证实千层纸素A 是否能够抑制SHCBP1 这一猜想，进行了Western blotting实验，结果也显示，10 μmol/L 千层纸素A 即显示出对SHCBP1 的抑制作用。此外，为了更好的评估千层纸素A 与靶点SHCBP1 之间的结合效能，分子对接结果表明千层纸素A 与SHCBP1 在多个位点形成氢键，结合能为−7.3 kcal/mol，表明SHCBP1 可能是千层纸素A 的重要的潜在作用靶点。为深入探究SHCBP1 作为治疗靶点的作用机制，首先对其在宫颈癌中的生物学功能开展分析，通过对SHCBP1共表达网络的分析获知SHCBP1及其共表达基因参与了TNF、HIF-1、IL-17 等多个信号通路，而TNF、HIF-1 和IL-17 信号通路均参与宫颈癌炎症的发生，表明SHCBP1 可能参与调节宫颈癌的炎症反应。在多个研究中，千层纸素A 在肿瘤中表现出良好的抗炎作用[14]，因此推断其抗炎机制可能与抑制SHCBP1 有关。

美国食品药品管理局批准帕博利珠单抗联合伴或不伴贝伐珠单抗的化疗用于一线治疗证实为肿瘤表达PD-L1 的持续性、复发性或转移性宫颈癌患者[22]。这是首个被批准用于这些患者一线治疗的抗PD-1 组合疗法，展示了免疫检查点抑制剂在治疗CESC 中的重要作用。本研究中，SHCBP1 与RAET1E、TGFB1、TNFRSF14、CXCR4 等多个免疫检查点相关，这些免疫检查点蛋白参与了人体先天和适应性免疫反应，在机体中发挥着重要的免疫调节作用[23-25]。免疫细胞浸润与肿瘤炎症反应息息相关，通过对22 种免疫细胞的分析，也获悉多种免疫细胞与SHCBP1 的表达相关，其中与SHCBP1 显著正相关的巨噬细胞，主要分为M0 型、M1 型和M2 型，在宫颈癌中分泌各种促炎因子，参与了肿瘤发生、发展。以上均表明SHCBP1 可能在CESC免疫中发挥着关键的作用，值得进一步的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突