吡格列酮调节AMPK/mTOR信号通路对肺癌A549细胞顺铂耐药的影响

张一思 孙静 张凡 李莉蓉 刘秀丽

肺癌是世界癌症相关死亡的重要原因之一,其中约80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1-2]。肺腺癌属于NSCLC,由于发病较隐匿,大多数患者确诊时已发展至中晚期[3]。基于顺铂(cisplatin,CDDP)的化疗方案是晚期NSCLC的标准治疗策略。但CDDP耐药严重影响患者生存率[4]。吡格列酮(pioglitazone,PIO)是一种胰岛素增敏剂,常用于治疗2型糖尿病[5]。研究发现,PIO具有抗癌症潜力[6],且已被建议作为肺癌的化学预防药物[7-8];但PIO对肺癌细胞化疗敏感性的影响鲜有报道。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路是调节肺癌细胞CDDP敏感性的重要通路,激活此通路促进肺腺癌对顺铂治疗的抵抗[9-10]。本研究将以肺癌CDDP耐药细胞株A549/CDDP为研究对象,创新性探讨PIO对肺癌细胞化疗敏感性的影响,为降低肺癌化疗耐药性提供参考。

资料与方法

一、细胞

人NSCLC耐顺铂细胞株A549/CDDP购自上海科学院细胞库。

二、主要试剂与仪器

吡格列酮(纯度≥98%,货号:CDS021593)购自Sigma-Aldrich公司[将PIO溶解在无菌二甲基亚砜(DMSO)中,并将储备溶液(10 mmol/L)等分储存在-20℃冰箱内,每次实验前在培养基中稀释成实验所需浓度];AMPK激活剂-AICAR(货号:ab120358)购自英国Abcam公司;RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司;CCK-8试剂盒购自江苏弘麒生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司;Transwell小室购自Corning公司;BCA蛋白定量检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR一抗和相应二抗购自美国Santa Cruz公司。酶标仪(Labserv K3)购自上海沃元科技有限公司;凝胶电泳仪(DYCZ-24EN)购自北京六一生物科技有限公司。

三、细胞培养

A549/CDDP细胞培养在含体积分数为10%的胎牛血清、2 μg/mL顺铂的RPMI-1640培养基中,在37℃、5%CO2的培养箱中进行常规培养。每2-3天更换一次新鲜培养基。取生长状态良好的对数生长期细胞用于后续实验。

四、细胞分组与处理

将对数生长期A549/CDDP细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中,待细胞贴壁后将其随机分为对照组(Control组)、CDDP组(10 μg/mL CDDP处理24 h[11])、PIO组(10 μmol/L PIO[8])、CDDP+低浓度PIO组(CDDP+L-PIO组,10 μg/mL CDDP+5 μmol/L PIO)、CDDP+高浓度PIO组(CDDP+H-PIO组,10 μg/mL CDDP+10 μmol/L PIO)和CDDP+高浓度PIO组+AMPK激活剂AICAR组(CDDP+H-PIO+AICAR组,10 μg/mL CDDP+10 μmol/L PIO+20 mmol/L AICAR[12])。分组后进行相应处理。

五、CCK-8法测定细胞增殖能力

取按方法四处理后的A549/CDDP细胞,继续置于细胞培养箱中培养24 h、48 h、72 h,在各时间点分别加入CCK-8试剂10 μL,继续孵育2 h,用酶标仪检测各组细胞在450 nm下的吸光度值(OD450)。

六、划痕实验检测细胞迁移能力

取对数生长期的A549/CDDP细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中,并按细胞分组与处理方法进行处理。待细胞约生长至80%,用20 μL无菌移液枪枪头垂直画出一道划痕,之后用PBS洗涤细胞,加入新鲜培养基继续培养48 h,用倒置显微镜观察0 h和48 h时细胞的迁移情况,并使用Image J软件分析计算细胞迁移率。迁移率=(0 h宽度-48 h的宽度)/0 h的宽度×100%。

七、Transwell实验检测细胞侵袭

在Transwell小室的底膜包被Matrigel基质胶,收集经细胞分组与处理过的A549/CDDP细胞并调整为浓度为5×105个/mL的单细胞悬液,取200 μL接种在Transwell小室中,并在下室中加入600 μL含有胎牛血清的培养基,培养24h取出小室,放置在4%多聚甲醛中固定30min,用棉签轻轻擦去上层细胞,加入0.1%结晶紫染色20 min。利用倒置光学显微镜观察穿过膜的细胞,每个小室随机选取6个视野进行拍照,并进行细胞计数。

八、流式细胞术检测细胞凋亡

将A549/CDDP细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板中,培养24 h后按细胞分组与处理方法对细胞进行相应处理。继续培养24 h后,加入胰蛋白酶消化收集细胞,用预冷的PBS洗涤2次。加入500 μL的Binding Buffer重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI于室温下避光反应15 min。采用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

九、Western Blot检测细胞AMPK/mTOR信号通路和凋亡相关蛋白的表达

取对数生长期的A549/CDDP细胞将细胞分组与处理。处理24 h后,加入胰蛋白酶离心收集细胞,加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白。根据BCA蛋白定量试剂盒操作说明对总蛋白浓度进行定量。之后经10% SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,加入脱脂奶粉于4℃进行封闭2 h。加入Bcl-2(1 ∶1000)、Bax(1 ∶1000)、Caspase-3(1 ∶1000)、AMPK(1 ∶1000)、p-AMPK(1 ∶1000)、mTOR(1 ∶1000)、p-mTOR(1 ∶1000)一抗于4℃下孵育过夜。次日,洗膜后加入相应二抗(1:5000)于室温下孵育2 h,加入ECL试剂进行显色,以GAPDH作为内参。在凝胶成像仪下进行曝光,利用Image Lab软件对目标蛋白的灰度值进行计算分析。

十、数据统计与分析

本研究所有实验数据采用Graph Pad Prism7.0软件进行统计分析。实验数据采用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05认为数据差异具有统计学意义。

结 果

一、PIO抑制A549/CDDP细胞的增殖能力

如(表1)所示,与Control组相比,PIO组细胞OD450值(48 h、72 h)显著下降(P<0.05),CDDP组无显著性差异(P>0.05);与CDDP组相比,CDDP+L-PIO组、CDDP+H-PIO组细胞OD450值(48 h、72 h)显著下降(P<0.05)。与CDDP+H-PIO组相比,CDDP+H-PIO+AICAR组和CDDP+L-PIO组细胞OD450值(48 h、72 h)显著上升(P<0.05)。

表1 各组细胞增殖能力(OD450)比较(n=6)

二、PIO抑制A549/CDDP细胞的迁移能力

如(图1)所示,与Control组相比,PIO组细胞迁移率显著下降(P<0.05),CDDP组无显著性差异(P>0.05)。与CDDP组相比,CDDP+L-PIO组、CDDP+H-PIO组细胞迁移率显著下降(P<0.05)。与CDDP+H-PIO组相比,CDDP+H-PIO+AICAR组和CDDP+L-PIO组细胞迁移率显著上升(P<0.05)。

图1 划痕实验检测细胞迁移

三、PIO抑制A549/CDDP细胞的侵袭能力

如(图2)所示,与Control组相比,PIO组细胞侵袭数目显著下降(P<0.05),CDDP组无显著性差异(P>0.05)。与CDDP组相比,CDDP+L-PIO组、CDDP+H-PIO组细胞侵袭数目显著下降(P<0.05)。与CDDP+H-PIO组相比,CDDP+H-PIO+AICAR组和CDDP+L-PIO组细胞侵袭数目显著上升(P<0.05)。

图2 Transwell实验检测细胞侵袭能力(结晶紫染色,×400)

四、PIO促进A549/CDDP细胞凋亡

如(图3)所示,与Control组相比,PIO组细胞凋亡率显著上升(P<0.05),CDDP组无显著性差异(P>0.05)。与CDDP组相比,CDDP+L-PIO组、CDDP+H-PIO组细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。与CDDP+H-PIO组相比,CDDP+H-PIO+AICAR组和CDDP+L-PIO组细胞凋亡率显著下降(P<0.05)。

图3 流式细胞术检测细胞凋亡率

五、PIO抑制A549/CDDP细胞中AMPK磷酸化并促进凋亡相关蛋白的表达和mTOR的磷酸化

如(表2和图4)所示,与Control组相比,PIO组细胞AMPK磷酸化水平、Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax、Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05),CDDP组无显著性差异(P>0.05)。与CDDP组相比,CDDP+L-PIO组、CDDP+H-PIO组细胞AMPK磷酸化水平、Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax、Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)。与CDDP+H-PIO组相比,CDDP+H-PIO+AICAR组和CDDP+L-PIO组细胞AMPK磷酸化水平、Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05),mTOR磷酸化水平、Bax、Caspase-3蛋白表达显著下降(P<0.05)。

图4 Western Blot检测细胞AMPK/mTOR信号通路和凋亡相关蛋白的表达

表2 各组细胞AMPK/mTOR信号通路和凋亡相关蛋白的表达比较(n=6)

讨 论

肺癌作为常见的恶性肿瘤之一,NSCLC是常见的肺癌类型,也是肺癌治疗的重点[13]。CDDP是治疗多种人类癌症(包括NSCLC在内)的关键药物,是细胞周期非特异性细胞毒药物,其抗肿瘤作用机制主要为通过破坏DNA和诱导细胞凋亡起作用。然而,在一段时间的治疗后获得性耐药不可避免地发展,是临床应用的主要限制[14]。目前CDDP的耐药机制较为复杂,研究者们主要认为可能与DNA修复损伤异常、细胞凋亡途径的激活等有关[15]。药物的协同组合可提高治疗效果,通常用于克服耐药性[16]。因此,提高NSCLC细胞对CDDP敏感性的新型安全组合对于成功治疗至关重要。本研究以CDDP耐药NSCLC细胞株A549/CDDP为研究对象,探究PIO对肿瘤细胞CDDP耐药性的影响。

PIO是一种过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂,已经发现PPAR-γ激活通过增加细胞凋亡来抑制肺癌细胞系的生长[17],并与NSCLC的化学耐药性相关[18]。Kiran等[19]研究发现PIO与塞来昔布联用能够显著抑制尼古丁衍生的亚硝胺酮诱导的NSCLC肿瘤细胞的生长,表明PIO联合塞来昔布可能是有效治疗NSCLC的药物。Seabloom等[20]研究发现固定剂量的PIO与二甲双胍联合可以预防肺癌的发生。本研究结果显示,与Control组相比,PIO组A549/CDDP细胞OD450值(48 h、72 h)、细胞迁移率、细胞侵袭数目、Bcl-2蛋白表达下降,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达升高,且相比PIO、CDDP单独处理,PIO与CDDP联合应用后可进一步降低A549/CDDP细胞增殖、迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡。这些结果说明PIO与CDDP联用能够显著提高CDDP耐药A549细胞对CDDP的敏感性。

AMPK/mTOR信号通路在多种疾病中均发挥着重要的调节作用。AMPK是一种异源三聚体蛋白,由α催化亚基和β、γ调节亚基组成,能调控细胞的能量代谢,mTOR是AMPK的下游效应子,AMPK的磷酸化可通过抑制mTOR活化来调控细胞的增殖、凋亡[21]。Zhu等[22]研究发现致癌基因-泛素偶联酶E2T可通过激活AMPK/mTOR信号通路诱导自噬,增加肺腺癌A549细胞的CDDP耐药性;Wu等[10]发现顺铂可增加A549细胞中的AMPK磷酸化,伴随着mTOR磷酸化的降低,AMPK/mTOR信号通路是参与CDDP诱导的A549和A549/CDDP细胞自噬反应的重要调节因子;以上研究表明AMPK/mTOR信号通路是调节A549/CDDP细胞CDDP耐药的重要靶点。在本研究中,PIO可降低A549/CDDP细胞中AMPK的磷酸化水平,升高mTOR磷酸化水平,且与CDDP联用后,AMPK的磷酸化水平进一步降低,mTOR磷酸化水平进一步升高,表明PIO能够抑制AMPK的活化,激活mTOR;推测PIO对A549/CDDP细胞CDDP敏感性的增强作用可能与AMPK/mTOR信号通路有关。通过用AMPK激活剂AICAR来干预CDDP与PIO共同处理的A549/CDDP细胞,结果发现,AICAR减弱了PIO对A549/CDDP细胞CDDP敏感性的增强作用;提示PIO可能通过抑制AMPK的活化,激活mTOR,进而增强A549/CDDP细胞对CDDP的敏感性。

综上所述,PIO可能通过调节AMPK/mTOR信号通路,减弱肺癌细胞的CDDP耐药性。本研究为临床治疗中降低NSCLC患者的CDDP耐药性提供了科学依据和参考。但本研究是在细胞水平上进行的研究,未探索其在体内的影响与机制,还需选择其他肺癌细胞系并进一步进行相关动物试验来验证PIO的抗肺癌作用。